1.4.3　DNA组装

DNA组装（DNA assembly）是指通过特定技术实现DNA序列的“切”和“连”，其是合成生物学的基础技术之一。在合成生物学和生物工程领域，遗传元件无缝拼接以及重复DNA序列串联，都需要用到高效的 DNA 组装技术，只有这样，才能满足发展迅速的基因组设计合成领域的需求。

基于酶切连接策略的DNA组装方法广泛应用于迭代DNA组装，主要有寡核苷酸组装方法、BioBrick方法、Golden Gate方法、Gibson方法以及TPA方法。现有的DNA合成方法较为有限，无法直接准确合成长片段DNA。对此，我们可以采用分级的体外与体内组装技术，将分段合成的寡核苷酸片段组配成长片段DNA，进而实现长片段基因甚至基因组的合成。

（1）寡核苷酸组装方法。寡核苷酸组装方法主要应用于长片段基因或基因组的合成。目前应用得较为广泛的寡核苷酸组装方法有连接酶组装法（ligase chain reaction，LCR）和聚合酶组装法（polymerase cycling assembly，PCA）两种。LCR通过DNA连接酶将首尾相连、重叠杂交的5′磷酸化寡核苷酸片段连接成双链DNA；PCA则利用DNA聚合酶延伸杂交的重叠寡核苷酸片段获得不同长度的混合物，最后用引物扩增出成功组装的基因全长片段。PCA具有良好的兼容性，也被应用于芯片合成的寡核苷酸组装。

（2）BioBrick方法。双链 DNA的拼接是依靠限制性内切酶产生的黏性末端来串联DNA片段。基于这一方法发展而来的BioBrick技术由Knight研究组于2003年提出。该方法通过一对同尾酶和两个非同尾酶将载体和DNA元件标准化并形成元件库，随后标准化的元件通过DNA连接酶作用根据顺序依次组装起来。基于作用位点的不同，BioBrick技术可以使用不同的同尾酶发挥不同的作用。虽然该方法实现了元件的标准化和DNA组装的便捷化，但由于两个DNA元件之间有6个碱基对的残痕，元件组装通量较低。之后出现的BglBrick方法和ePathBrick方法通过将残痕转化为融合蛋白的连接肽，成功解决了这个问题，推动了组装技术的发展。

（3）Golden Gate方法。Golden Gate 方法采用IIS型限制性内切酶切割产生的黏性末端来实现组装，由于IIS型限制性内切酶识别位点与切割位点有所不同，Golden Gate 技术可以自由地设计黏性末端，从而实现同时组装多个DNA片段，大大提高了DNA组装的效率。例如，Engler 等人用Golden Gate方法进行一步酶切连接，结合基因改组（gene shuffling）技术，一次性完成了3个片段与载体的拼接，构建了理论上可达19683种不同的重组胰蛋白酶原基因，得以筛选高效表达的胰蛋白酶突变体。

（4）Gibson方法。Gibson方法由Gibson于2009 年开发，是一种简单、快速、高效的DNA定向无缝克隆技术，可将插入片段（PCR产物）定向克隆至任意载体的任意位点。Gibson方法的原理可以概括为三步反应：首先，T5核酸外切酶从DNA片段的5′端切割一条链，产生的单链DNA末端（overhang）两两配对，形成一个有间隙（gap）的环状DNA；其次，Phusion DNA聚合酶通过DNA合成填补间隙，产生一个只有缺刻（nick）的环状DNA；最后，Taq DNA连接酶通过形成磷酸二酯键修复缺刻，得到一个完整的双链DNA或质粒。相比其他DNA组装方法，Gibson方法连接利用的是片段间的长重叠区域，更特异性地确保了连接顺序，同时做到了无缝拼接，使得组装尺度扩大到了百kb级左右。

（5）TPA（Twin-Primer Assembly）方法。与上述几种酶依赖性DNA组装方法不同，TPA方法不需要酶的参与。TPA方法是由赵惠民团队于2017年提出的一项双引物非酶促DNA组装的高效准确的多片段DNA组装方法。其原理可分为两步：首先，设计出长短、上下不同的4种引物，并利用聚合酶链式反应，分别对设计的片段进行扩增；其次，将得到的正确的扩增片段通过退火组装成一个质粒，验证正确后转化到菌内即可。TPA方法在不使用酶的条件下，将聚合酶链式反应扩增的片段组装成质粒，具有广阔的应用前景。