1.4.2　DNA测序

测序是重建DNA样本中核苷酸原始顺序的过程。DNA测序（DNA sequencing）技术分为一代Sanger测序、二代以Illumina测序平台为代表的高通量测序和三代单分子测序。1977年，Maxam和Gilbert等发明的化学降解法与Sanger等发明的双脱氧核苷酸末端终止法，标志着一代测序技术的诞生。Sanger测序技术是通过核酸模板在核酸聚合酶、引物、4种单脱氧核苷酸存在的条件下，在4管反应体系中分别按比例引入4种脱氧核苷酸，反应终止后用凝胶电泳分离大小不同的片段。其技术流程为文库制备、测序反应、测序示踪和计算机分析。

目前普遍使用的是二代测序技术，即以大规模并行方式读取相对较短的序列（片段），其步骤如下。

（1）将长序列切割为片段并使用聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增。

（2）将DNA接头序列连接到扩增完成后的各条DNA链的两端。

（3）将双链DNA分离成单链并加入玻璃流动池，接头序列与流动池表面上的互补片段结合，并局部复制以产生相同DNA克隆簇。

（4）将被荧光标记的互补核苷酸加到每个克隆簇中的单链DNA末端，记录荧光颜色对每个克隆簇中的DNA进行测序。

（5）被荧光识别到的碱基结果会以文本格式存储。

二代测序技术具有成本低廉、快速和准确等特点，但其使用的短读长测序方式对片段长度具有严格限制。

以Oxford Nanopore Technologies公司的纳米孔单分子测序技术和Pacific Biosciences公司的single molecule real-time（SMRT）测序技术为代表的三代单分子测序技术近年来受到了学术界的广泛关注。与前两代测序技术相比，三代测序技术的特点是通过单分子测序实现长片段测序，从根本上改变测序数据的结构，提高测序能力。其中，SMRT测序技术利用荧光信号进行测序，而纳米孔单分子测序技术则利用不同碱基产生的电信号进行测序。纳米孔单分子测序技术的仪器小巧便携、成本较低且无须复杂的建库过程，使其可应用于快速、实时的基因测序中，在科学研究和临床应用中都有着非常重要的意义，具有广阔的应用前景。