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第三节 梅毒螺旋体血清学试验
梅毒螺旋体血清学试验（又称梅毒特异性抗体检测）方法主要有梅毒螺旋体颗粒凝集试验（treponema pallidum particle agglutination，TPPA）、梅毒螺旋体血球凝集试验（treponema pallidum hemagglutination assay，TPHA）、化学发光免疫试验（chemiluminescence immunoassay，CLIA）、酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、免疫层析试验（immunochromatography test，ICT）、荧光螺旋体抗体吸收试验（fluorescent treponemal antibodyabsorption，FTA-ABS）、免疫印迹试验（Western blotting，WB）等。
一、梅毒螺旋体颗粒凝集试验（TPPA）
1.检测原理
超声裂解梅毒螺旋体后，提取抗原包被在明胶颗粒上后，与样本中的抗梅毒螺旋体抗体结合，产生肉眼可见的凝集反应。明胶粒子为玫瑰红色，肉眼即可观察结果。
TPHA采用的是处理的羊或禽类红细胞代替明胶颗粒，其基本原理及实验室操作步骤均同TPPA。
2.检测准备 （1）试剂盒：
复溶液（标记为A液），用于溶解致敏粒子、未致敏粒子和质控血清；标本稀释液（标记为B液），用于稀释血清标本；致敏粒子（标记为C），用前30分钟按规定量加A液溶解并混匀；未致敏粒子（标记为D），用前30分钟按规定量加A液溶解C和D并混匀，作为C液和D液备用；质控血清（标记为E液）。
（2）其他：
U型微量反应板；移液器；保湿盒；微量板振荡器。
3.标本采集
同“RPR”。
4.检测流程
（1）试验前半小时将试剂置室温平衡到15～30℃。
（2）B 液加至微量反应板孔内，第 1 孔 100μl，第 2、3、4 孔各 25μl。
（3）取血清25μl加至第1孔，混匀后依次倍比稀释至第4孔，混匀后弃去25μl。
（4）第 3孔加D液（未致敏粒子混悬液）25μl，第4孔加 C液（致敏粒子混悬液）25μl。
（5）将反应板置振荡器振荡30秒。
（6）放置于有盖湿盒中，15～30℃条件下避光孵育2小时后观察结果。
（7）结果判读
1）2+：产生均一的凝集，凝集粒子在底部整体上呈膜状延展；
2）1+：粒子环明显变大，其外周边缘不均匀，且杂乱地凝集在周围；
3）±：粒子形成小环状，呈现出外周边缘均匀且平滑的圆形；
4）-：粒子呈扣状聚集，呈现出外周边缘均匀且平滑的圆形。
5）血清在1∶80稀释度与致敏粒子发生凝集反应（1+或更强），与未致敏粒子（第3孔）不发生凝集反应为阳性反应。血清与致敏粒子和未致敏粒子均不发生凝集反应为阴性反应。试验结果为“±”时，待复查。
5.结果报告
（1）阳性。
（2）阴性。
6.临床意义
（1）作为非梅毒螺旋体血清学试验阳性标本的确证试验，可用来排除其生物学假阳性。
（2）感染梅毒螺旋体并产生特异性抗体后，即使经过规范化治疗，绝大部分患者仍终身阳性。因此梅毒螺旋体血清学试验在临床诊疗时不能作为疗效观察、判断复发及再感染的指标；用于梅毒筛查时，其阳性结果需结合非梅毒螺旋体血清学试验结果、流行病学史、临床表现及治疗史等综合判断，以排除梅毒的既往感染。
（3）特异性抗体窗口期最长可至4周，如感染不足4周，该试验可为阴性。
7.注意事项
（1）如未致敏颗粒出现凝集反应，待血清进行吸收后再进行试验，或改用其他梅毒螺旋体血清学试验方法。
（2）血清吸收处理方法
1）取0.95ml已恢复体积的未致敏颗粒加入清洁的小试管内。
2）试管内加入50μl血清标本并充分混匀，在15～30℃放置20分钟或更长时间。
3）2000转/分钟离心5分钟，取25μl上清液（血清标本稀释1∶20）放置于第3孔，注意不要混入颗粒。
4）从第4孔至最后一孔各加25µl B液。
5）自第3孔吸25µl至第4孔，混匀后依次倍比稀释至最后一孔，弃去最后一孔中吸出的25µl。
6）按定量试验法加入D液和C液，将反应板置微量板振荡器上振荡30秒，放置于湿盒内，15～30℃条件下孵育2小时观察结果。
（3）质控血清：E液滴度为1∶320，可作为结果判读的阳性参照及试剂盒的有效性评价。
二、化学发光免疫试验（CLIA）
1.检测原理
化学发光免疫试验包含免疫反应系统和化学发光分析系统，即将化学发光体系与免疫反应相结合，用于检测抗体的一种新型标记免疫测定技术。化学发光法主要包括电化学发光、微粒子化学发光等多种方法。
2.检测准备
试剂盒、化学发光免疫分析仪。
3.标本采集
同“RPR”。
4.检测流程
（1）根据不同试剂盒说明书进行操作，包括：仪器和试剂盒准备、上载样品、检测、结果读数记录。
（2）结果判读：根据化学发光免疫分析仪测量的发光值（RLU）自动判读结果。标本RLU值大于或等于Cut-off值为阳性反应，小于Cut-off值为阴性反应（或按各试剂要求判定结果）。
5.结果报告
（1）阳性。
（2）阴性。
6.临床意义
同“TPPA”。
7.注意事项
（1）血清标本应注意不含或极少含红、白细胞，否则可能会导致假阳性结果。
（2）黄疸或严重污染的样本将导致错误的结果。
（3）样本中含有叠氮钠会影响试验结果，不能用叠氮钠做样本防腐剂。
（4）如果结果存在疑问，可采用TPPA或其他方法进行验证。
三、酶联免疫吸附试验（ELISA）
1.检测原理 用经纯化及超声裂解处理的梅毒螺旋体，或经纯化的梅毒螺旋体重组蛋白作为抗原包被固相板条，与待检样本中的抗梅毒螺旋体特异性抗体和辣根过氧化酶标记的抗人IgG抗体结合，通过酶促反应底物显色以检测患者血清中的抗梅毒螺旋体特异性抗体。
2.检测准备
（1）试剂盒含包被梅毒螺旋体抗原的反应板（96孔）；标本稀释液；洗涤液，使用前按说明书要求稀释；酶结合物；底物液（A液和B液）；反应终止液；阳性对照血清；阴性对照血清。
（2）酶标仪。
3.标本采集 同“RPR”。
4.检测流程 手工操作试验基本步骤如下（全自动酶标检测仪，根据试剂和设备使用说明书操作）：
（1）加样，取标本稀释液加到反应板孔内，再加入待检血清，同时作阳性和阴性对照，37℃条件下孵育一定时间。
（2）洗板，拍干。
（3）加酶结合物，37℃条件下孵育一定时间。
（4）洗板，拍干。
（5）加底物液A液、B液，37℃条件下避光孵育一定时间。
（6）加终止液，终止反应。
（7）放置于酶标仪中，在450nm波长测定光密度（optical density，OD值），或450nm/630nm波长测定光密度。
（8）结果判读：根据酶标仪测量OD值，自动判读结果。标本OD值大于或等于Cut-off值为阳性反应、OD值小于Cut-off值为阴性反应。
5.结果报告
（1）阳性。
（2）阴性。
6.临床意义同“TPPA”。
7.注意事项
（1）不同批号试剂不能混用。
（2）反应的温度和时间必须严格控制。
（3）如果结果存在疑问，可采用TPPA或其他方法进行验证。
四、免疫层析试验（ICT）
1.检测原理
用经纯化的梅毒螺旋体特异性重组蛋白作为抗原包被固相膜条，血液标本经过毛细作用形成抗原抗体免疫标记复合物，吸附到限定位置膜条上，观察到显色条带，可以直接判读结果。
2.检测准备
（1）试剂盒主要包括测试板、一次性滴管。
（2）定时器。
3.标本采集
（1）血清、血浆标本同RPR。
（2）全血：用一次性采血针采集指尖血后，立即用于检测。
4.检测流程 （1）检测步骤：
不同试剂盒检测步骤有所不同，其基本流程如下：
1）用一次性滴管或移液器滴加一定量待检标本（全血、血清或血浆）于加样孔中。
2）可根据需要在加样孔中加入一定量的缓冲液。
3）根据试剂盒要求，在室温下反应相应时间。
（2）结果判读
1）质控位置应出现显色条带，说明试验有效。否则本次试验无效，需重测。
2）标本检测位置如出现显色条带，说明样品中含有梅毒螺旋体抗体，结果为阳性。若该位置无显色条带，则没有抗体，为阴性。
5.结果报告
（1）阳性。
（2）阴性。
6.临床意义
同“TPPA”。
7.注意事项
（1）如果结果存在疑问，可用TPPA或其他方法进行验证。
（2）如出现无效结果，重新测试。如果问题仍然存在，应停止使用该批号产品。
五、荧光螺旋体抗体吸收试验（FTA-ABS）
1.检测原理
将梅毒螺旋体固定在玻片上，与经吸收剂吸收的待测血清反应形成抗原抗体复合物，再加入荧光素（FITC）标记的抗人免疫球蛋白，形成带有荧光的抗原抗体复合物，在荧光显微镜下，螺旋体显出苹果绿色荧光。
2.检测准备
（1）吸收剂：吸收剂（5ml冷冻干燥品）由体外培养的梅毒螺旋体Reiter株制备而成。使用前用无菌蒸馏水复溶。
（2）荧光抗体：用荧光素标记的羊或鼠抗人免疫球蛋白。
（3）血清稀释板。
3.标本采集
同“RPR”。
4.检测流程
（1）血清样本用吸附剂吸附一定时间。
（2）将吸附后的样本加到抗原片上，按试剂盒规定的时间和温度孵育。
（3）洗涤。
（4）加入一定浓度的荧光抗体，按试剂盒规定的时间和温度孵育。
（5）洗涤。
（6）抗原片加固封剂（甘油缓冲液）1滴，覆以盖玻片。在荧光显微镜下观察。
（7）试验对照：每批次试验包括下列对照。
1）4+阳性血清和1+阳性血清对照，血清用PBS液和吸收剂分别按1∶5～1∶20稀释。
2）非特异血清对照。
3）染色对照：用0.01mol/L PBS和吸收剂分别替代荧光抗体。
（8）结果判读：与不同阳性强度的对照血清相比，荧光显微镜下梅毒螺旋体的荧光强度等于或强于1+对照血清，判断为阳性反应；无荧光判断为阴性反应；有微弱荧光但弱于1+对照血清判断为临界反应，需重复试验或用其他梅毒螺旋体血清学试验证实。
5.结果报告
（1）阳性。
（2）阴性。
6.临床意义
同“TPPA”。
7.注意事项
（1）抗原片每次洗涤要干净，避免其他杂质影响判读结果。
（2）判读结果需根据不同强度阳性对照和阴性对照结果进行判读。
（3）试验需要高质量荧光显微镜，由技术熟练的操作人员操作完成。
六、免疫印迹试验（WB）
1.检测原理
采用超声粉碎梅毒螺旋体后全螺旋体作为抗原，或基因重组的梅毒特异性抗原，转印至硝酸纤维膜条上，捕获样品中梅毒抗体，再与标记物结合抗体反应形成复合物，通过酶促底物反应，可识别针对不同分子量抗原的特异性IgG或IgM抗体。
2.检测准备
（1）免疫印迹试验试剂盒：试剂盒主要包括缓冲液、酶结合物、底物、免疫印迹检测膜、温育反应槽等。
（2）恒温干式/水浴箱、侧摆摇床。
3.标本采集
同“RPR”。
4.检测流程
（1）在置有检测膜的温育反应槽中加缓冲液，按照试剂盒要求温育一定时间后吸去。
（2）立即加入血清，反应一定时间后吸去。
（3）用缓冲液清洗检测膜3次。
（4）加入酶结合物，反应一定时间后吸去。
（5）加入底物，反应一定时间后吸去。
（6）加入蒸馏水终止反应，判读结果。
（7）结果判读：在规定时间内判读结果。观察质控条带，判断试验有效性，如没有出现质控条带，说明试验无效，需重复试验。根据测试区显色条带出现情况，对照试剂盒说明书描述的条带组合阳性判断标准，对待测样品进行阳性或阴性反应判断。
5.结果报告
（1）IgG或IgM阳性。
（2）IgG或IgM阴性。
6.临床意义
（1）梅毒特异性抗体IgM有助于胎传梅毒、神经梅毒及一期梅毒的早期诊断。
（2）作为常规梅毒螺旋体血清学试验检测时，应同时检测IgG及IgM抗体，任何一种抗体阳性的临床意义均同TPPA。
7.注意事项
建议在试验中增加阳性对照，以判断试验是否有效。