第三节　酶联免疫斑点技术

一、概述

（一）酶联免疫斑点技术的概念与基本原理

酶联免疫斑点检测（enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT assay）结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术（ELISA），用抗体捕获培养中的细胞分泌的细胞因子，能够在单细胞水平检测细胞因子的分泌情况，并以酶联斑点显色的方式表现出来。

其基本原理为：细胞受到刺激后局部产生细胞因子，该细胞因子被特异性单克隆抗体捕获。洗去分泌细胞后，被捕获的细胞因子与生物素（biotin） 标记的二抗结合，再与碱性磷酸酶（alkaline phosphatase， AKP） 或辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase， HRP） 标记的链亲和素结合。经底物（BCIP/ NBT）孵育后在PVDF 孔板出现有色斑点，即表明细胞产生了细胞因子，通过显微镜或ELISPOT 酶联斑点分析系统对斑点进行分析即可获得结果。

（二）酶联免疫斑点技术的优点

1.灵敏度高

在100万个阴性细胞中只要有一个分泌细胞因子的阳性细胞，即可被检测出来。这是目前为止最为灵敏的相关检测技术，灵敏度比传统的ELISA方法高2～3个数量级。

2.单细胞水平活细胞功能检测

ELISPOT检测的是单个细胞分泌，而非细胞群体平均分泌。在检测过程中，需进行活细胞培养与抗原刺激阶段，检测的是活细胞功能，而非死细胞的遗留物。

3.操作简便经济，可进行高通量筛选

ELISPOT没有复杂的细胞体外扩增过程，不使用同位素，不需要大型专门的实验仪器设备。按照标准化实验操作，一个实验者可以同时处理数百个样品，效率远远高于其他检测方法。

二、酶联免疫斑点的关键技术

影响ELISPOT斑点频率的因素很多，但最重要的影响因素为被检测细胞状态、整个实验过程中细胞所接触到的内毒素及其他敏感成分、刺激物的质量与纯度。

（一）待检细胞状态

状态好、活力高、功能保持完好的细胞，ELISPOT检测时必定背景干净、负对照斑点少，实验组斑点圆润漂亮，且结果的可重复性好，数据真实可信。

ELISPOT待检细胞可分为新鲜分离的细胞、冻存复苏的细胞两类。对于前一类细胞，为使细胞始终处于最佳状态，需要采取经过优化、标准化的细胞分离方法，尽量减少机械损伤（例如：通过机械方法制备小鼠脾脏单个细胞）及有毒化学物质（例如：淋巴细胞分离液、消化酶类）对细胞的损害。而后一类细胞情况就更加复杂了，冻存与解冻对细胞本身就是很大的伤害，细胞冻存中使用的一些保护剂（例如：DMSO）虽能减少冻存对细胞的伤害，但这些保护剂本身就具有生物毒性，也会损伤细胞、影响细胞状态。因此，ELISPOT技术对细胞冻存与复苏提出了更加严格的要求，不单单要求细胞存活率高，还要求细胞的免疫功能在冻存前后不发生改变。传统的细胞冻存、复苏方法已不能满足要求，国外较早从理论与实践上已经摸索出一套行之有效的适应ELISPOT功能检测要求的细胞冻存、复苏方法，可保证很高的存活率（90%），且斑点形成细胞SFC频率保持不变。有些公司已经把细胞冻存、复苏程序经过优化而固定下来了，还开发了相应的细胞冻存液，可以对细胞提供额外的保护，例如：荷兰U-Cytech公司推出专门针对ELISPOT检测的细胞冻存液，辅以标准化冻存、复苏程序，效果极佳。

（二）内毒素

极低浓度的内毒素也可以非特异性刺激T淋巴细胞分泌细胞因子，对ELISPOT斑点频率测定产生极大干扰。因此，要从各个环节关口严格把控ELISPOT检测中活细胞所能接触到的内毒素。①要选择口碑好、产品内毒素含量低的ELISPOT试剂产品。②要控制培养基和血清，最好选购低内毒素的产品，每一批次都要做验证。③要控制整个实验操作做到严格无菌。

特别是血清，除了含有内毒素会增加负对照的斑点数目之外，还可能含有其他未知ELISPOT敏感成分，增加或抑制斑点的生成。为了彻底解决这一问题，最好采用无血清ELISPOT技术，即在ELISPOT刺激孵育中使用不含血清的培养基。目前，适用于人PBMC细胞的无血清培养技术已经成熟，荷兰U-Cytech公司开发了专门针对人PBMC细胞的ELISPOT无血清培养基，化学成分完全限定，且与ELISPOT技术需求兼容，完全消除了血清对检测的干扰作用。

（三）刺激物

选择特异性刺激物的原则是成分尽可能简单、纯度尽可能高。①首推T淋巴细胞表位肽，因其成分简单、特异性最好。但是由于涉及MHC分子类型匹配的问题，若实验对象MHC类型不明，则要选择多个T淋巴细胞表位肽，通过实验验证效果。②如果没有抗原蛋白的T细胞表位信息，亦无相应文献参考，最好选择重叠多肽池。目前的生物信息学技术可帮助预测蛋白质序列上潜在的T细胞表位肽，根据预测结果，在潜在的T细胞表位肽附近合成一系列重叠多肽，混合成多肽池，也能对特异性细胞免疫反应做出有效刺激。以上两类多肽均为人工合成，特别要注意合成纯度越高越好（最好在90%以上）以及合成过程中的质量控制，注意避免内毒素污染。③再次一级的刺激物是重组蛋白。值得注意的是，在大肠杆菌中重组表达的蛋白质完全不可用，因其含有的大肠杆菌成分及内毒素极高。最好选择在哺乳动物细胞中表达的蛋白质，与ELISPOT的相容性最佳；昆虫杆状病毒载体表达的蛋白纯度较高，也可以使用。使用酵母载体表达的蛋白，经多次验证后亦可获得较好效果。④若无法获得上述化学成分单一且已知的抗原刺激物，而被迫使用成分未知的提取物时，必须多次验证、多设对照及重复孔。一般来说，这类刺激物会产生较多非特异性斑点，在不同的实验对象个体之间会产生较大差异。