第四节 免疫组织化学技术
一、概述
（一）免疫组织化学技术的概念与基本原理
免疫组织化学（immunohistochemisrty，IHC）技术是指将显示剂（荧光素、酶、金属离子、同位素等）标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体特异性反应和组织化学呈色反应，对相应抗原进行定位、定性及定量测定的一项技术。
免疫组织化学技术将抗原抗体反应的特异性和组织化学的可见性有机结合，借助光学显微镜、电子显微镜和（或）荧光显微镜等的显像和放大作用，检测组织或细胞中各种抗原或半抗原物质（蛋白质、多肽、酶、激素、病原体、受体以及氨基酸、多糖、磷脂、核酸等）的组织分布、表达丰度及亚细胞定位。此技术以其特异性及灵敏度高、操作比较简便而得以广泛应用。
（二）免疫组织化学技术的分类
①按照标记物质的种类，荧光染料、放射性同位素、酶（主要为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、酶标法、免疫金银法等。
②按照染色步骤可分为直接法（又称一步法）、间接法（二步、三步或多步法）；与直接法相比，间接法的灵敏度显著提高。
③按照结合方式可分为抗原-抗体结合，例如，过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法；亲和连接，例如，卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接（SP）法等，其中SP法最常用。
（三）常用免疫组织化学方法
在抗体制备上，经历了从抗血清、纯化IgG到单克隆抗体，甚至发展到应用基因重组技术获得分子量较小的特异性片段。其中，单克隆抗体现已广泛应用于研究中，所具有的高特异性大大提高了免疫组织化学技术水平。同时，显示技术的发展亦相当迅猛，可通过标记物发出荧光、酶促反应产生有色沉淀、高电子密度颗粒等，借助荧光显微镜、光学显微镜或电子显微镜观察抗原抗体复合物所在部位。
1.免疫荧光方法
为最早建立的免疫组织化学技术。利用抗原抗体的特异性结合，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。抗原抗体复合物中的荧光素受激发光照射后即发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，在临床病理诊断、检验中应用比较广泛。
2.免疫酶标方法
免疫酶标方法是继免疫荧光后，于20世纪60年代发展起来的技术。先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶底物，生成有色不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内各种抗原成分进行定位研究。免疫酶标技术是目前最常用的技术。本方法与免疫荧光方法相比的主要优点是：定位准确、对比度好、染色标本可长期保存，适合于光镜、电镜研究等。免疫酶标方法的发展非常迅速，已衍生出多种标记方法，且随着方法的不断改进和创新，其特异性和灵敏度都在不断提高，使用也越来越方便。目前在病理诊断中广为使用的有PAP法、ABC法、SP法等。
3.免疫胶体金技术
以胶体金这种特殊金属颗粒作为标记物。胶体金是指金的水溶胶，能迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白的生物学活性无明显影响。因此，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子（如葡萄球菌A蛋白）等作为探针，能对组织或细胞内抗原进行定性、定位，甚至定量研究。由于胶体金有不同大小的颗粒，且胶体金电子密度高，因此免疫胶体金技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。由于胶体金本身呈淡至深红色，也适合进行光镜观察，应用银加强的免疫金银法则更便于光镜观察。
（四）免疫组织化学技术的优点
1.特异性强
免疫学的基本原理决定了抗原与抗体之间的结合具有高度特异性，因此，免疫组织化学从理论上讲也是组织细胞中抗原的特定显示，例如：角蛋白（keratin）显示上皮成分，LCA显示淋巴细胞成分。只有当组织细胞中存在交叉抗原时才会出现交叉反应。
2.敏感性高
在免疫组织化学技术应用的起始阶段，受直接法、间接法等敏感性不高的技术限制，抗体只能稀释几倍、几十倍。ABC法、SP法的出现，使抗体稀释上千倍、上万倍甚至上亿倍后仍可在组织细胞中与抗原结合，这样高敏感性的抗体抗原反应，使免疫组织化学方法越来越方便于常规病理诊断工作。
3.定位准确、形态与功能相结合
该技术通过抗原抗体反应及呈色反应，可在组织和细胞中进行抗原的准确定位，因而可同时对不同抗原在同一组织或细胞中进行定位观察，可以进行形态与功能相结合的分析，对病理学深入研究意义重大。
二、免疫组织化学的关键技术
免疫组织化学的染色方法虽有很多类型，但有关染色的基本技术却是相同的，既有一般病理切片染色的基本要求，也涉及与抗原抗体特异性反应有关的特殊要求。虽然染色方法有多种类型，但染色过程中都需要采取一些基本技术方法，以增强抗原抗体特异性反应，降低或消除非特异性反应，使染色结果达到最佳效果。
（一）取材
实验动物、人体组织细胞和体外培养细胞都可作为免疫组织化学研究的材料。对于所取材料不仅要保持组织细胞形态的完整，而且还要使抗原的抗原性不被破坏，以利于抗原抗体结合。因此，在取材时要求做到准确、迅速、完整、具有代表性，以免因取材不当造成抗原丢失或破坏，从而影响实验结果的正确性。
1.实验动物
实验动物种类很多，以狗、兔、大鼠、小鼠等为常用。取材前先常规麻醉或将动物快速处死，迅速取材。注意取材用的剪刀和刀片等要无菌处理，所取材料不应太大，以厚度不超过3mm为宜。在取小型实验动物材料时，先经左心室主动脉灌注固定，使灌注液迅速到达全身，则固定更加充分。灌注固定时先用小量生理盐水快速将血液冲洗干净，紧接着用4%多聚甲醛灌注，灌注速度先快后慢。
2.人体材料
在病理诊断和研究中，通过尸体解剖、活检、手术切除标本，以及通过各种方法收集的各类细胞（脱落细胞、血细胞、组织中分离提纯的细胞等）等都可用于免疫组织化学研究。
（1）尸体解剖标本的取材 应尽早取材固定，死亡时间过长后采集的标本，由于组织发生自溶，抗原已变性或弥散、消失，染色结果不一定能反映实际情况。
（2）活检标本的取材 活检标本取材于体表、空腔脏器内壁、实质性器官，例如：皮肤、口腔、鼻咽、喉、胃、肾、肝等。取材常用活检钳钳取，所取材料较小，并常因挤压而变形。因此，取材时活检钳的刀口应锋利，以减少对组织的挤压；所取部位要具有代表性，尤其是病变部位较大时。
（3）手术切除标本的取材 应根据标本大小采用相应的取材方法。对小标本的处理，可先在固定液内固定，再修切成适宜大小继续固定。对大标本的处理，鉴于抗原在组织中分布的差异，所取材料要包括主要病灶、病灶与正常组织交界处、病灶周围的正常组织、正常组织的不同代表性部位等。
（4）细胞标本的取材
①印片法：将载玻片轻贴于暴露的病变区，使脱落细胞黏附在玻片上，经固定后即可用于染色。此法优点是简便省时、细胞抗原也保存较好；缺点是细胞分布不均甚至重叠在一起，影响染色结果。主要适用于活检和手术切除标本。
②穿刺涂片法：用穿刺针抽取病变区液体成分，直接或经离心后制成细胞悬液，涂片、固定、染色。此法主要用于实质性器官内细胞采集，例如：淋巴结、肝、肾、肺等。
③体液细胞的制备：细胞成分较多的体液标本（血液、淋巴液、精液等），取少量液体直接涂片即可。细胞成分较少的体液标本（腹水、胸水、脑脊液等），可先用离心沉淀法使细胞浓缩，制成细胞悬液后涂片；亦可用细胞离心涂片器直接涂片。
④体外培养细胞标本的制备：应根据所培养细胞的生物学特性采用不同的方法。对于贴壁生长的细胞（内皮细胞、成纤维细胞、神经胶质瘤细胞等），可在培养瓶或培养板的底壁放置载玻片，让细胞在其上贴壁生长，适时将载玻片取出进行固定染色即可。对于悬浮生长的细胞则可采取离心沉淀涂片的方法。
（二）固定
固定的目的在于保持组织形态和结构完整，并尽量保存组织中的抗原，使其不被破坏或扩散，以减少非特异性染色或假阳性、假阴性结果。如果固定不及时或固定不当，都可使组织结构不清晰或特异性抗原不显示，影响结果判断。由于不同抗原稳定性不同，不同固定剂的性能也各异，因此，了解所研究抗原的化学性质、根据需要选择适当的固定剂和固定方法是必不可少的。为充分保存组织中的抗原，对所取标本应立即固定包埋。若暂时不固定则应在低温下（干冰、液氮或低温冰箱等）保存备用。选择固定方法的原则是在保持组织形态结构完好和被检测抗原不被破坏的前提下，采用浓度最低的固定剂和最短的固定时间，固定时间一般为1～2h。
1.常用固定剂
（1）醛类固定剂 属双功能交联固定剂，其作用是使组织之间互相交联，将抗原保存在原位。特点是对组织穿透性强、收缩性小，常用类型有甲醛、多聚甲醛、戊二醛，可单种或多种固定剂联合使用。主要包括甲醛缓冲液、4%多聚甲醛磷酸缓冲液、戊二醛-多聚甲醛磷酸缓冲液、Bouin液、PLP液（过碘酸-赖氨酸-多聚甲醛固定液）。
（2）丙酮及醇类固定剂 主要是使组织中的蛋白质和糖沉淀。此类固定剂穿透力强、对抗原保存较好，但对小分子蛋白质及多肽等物质的保存效果较差，常与冰醋酸、乙醚、氯仿等其他固定剂混合使用。主要包括AAA液、Clzrke改良液、Carnoy液、丙酮。
（3）其他固定剂 Zenker液、碳二亚酰胺-戊二醛液、四氧化锇（锇酸）液。
2.固定注意事项
（1）固定液的选择 用于免疫组织化学的固定剂种类很多，应根据理论与反复的实践来决定。选择最佳固定剂的标准是：①组织的形态结构保存良好；②最大限度保存抗原的抗原性。中性甲醛、多聚甲醛是应用最广的固定剂。
（2）组织块的大小 以1.5cm×1.5cm×0.5cm为宜。
（3）固定时间及温度 根据组织块大小、固定剂种类及浓度来决定，固定时间与组织块大小成正比、与固定剂浓度成反比。一般在室温下进行，电镜标本或固定时间较长时可放置在4℃冰箱。
（4）固定后处理 组织经固定后必须冲洗，除去多余的固定剂，以消除固定剂对染色的影响。
（三）包埋
包埋的目的是使组织块保持一定形状和硬度，便于切片机切片。目前实验室常用的包埋方法仍以石蜡包埋和冷冻包埋为主。前者的优点是组织结构保存良好、清晰，抗原定位良好，在病理和回顾性研究中有较大实用价值；后者的突出优点是能够较好地保存多种抗原的抗原性，制片时间短，能在短时间内出结果，适于手术切除标本的快速诊断。
1.石蜡包埋
石蜡、环氧树脂等是组织病理切片最常用的包埋剂。应用于免疫组织化学研究的石蜡包埋需做到：①脱水、透明等过程应尽量在温度较低的环境下进行，以尽量减少组织抗原的损失；②组织块可尽量修整得小些，以利于充分脱水、透明和浸蜡；③浸蜡包埋常用熔点低的软蜡。
2.塑料包埋
步骤较多，易造成抗原丢失，因此有时做包埋前染色。电镜观察前先切成0.5～2μm的半薄切片，光镜下定位，以提高检测准确性。
3.冷冻包埋
新鲜及已固定材料均适于冷冻包埋切片，用于光镜观察的塑料包埋可冷冻包埋。冷冻包埋能较好保存抗原，冷冻时组织中可能会有冰晶出现，将破坏细胞结构，造成抗原扩散。为减少冰晶的形成，可将组织置于高渗溶液中以减少水分，或用干冰或液氮速冻。
4.碳蜡包埋
聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）为水溶性蜡，分子量大小不等，用于包埋的是PEG 1500和PEG 4000两种，其熔点分别为38℃和52℃。碳蜡包埋无须脱水、透明，用滤纸吸干已固定组织块表面水分后，即可直接浸蜡包埋。包埋块应低温干燥保存。
（四）切片
切片要薄而平整。免疫组织化学染色较长，容易发生脱片现象。为防止脱片，一般在贴片前要对载玻片做清洗、涂胶处理。涂胶的目的在于增加切片黏附的牢度，常用明胶（例如：钒明胶、甲醛明胶）、树脂胶、多聚赖氨酸、商品黏附剂等。
（五）抗原修复
经甲醛固定的部分组织细胞，对免疫组织化学标记敏感性明显降低，这因为甲醛固定过程中形成醛键或保存的甲醛会形成羧甲基而封闭部分抗原决定簇。因此，染色时有些抗原需先进行修复或暴露。抗原修复方法可分为化学、物理方法。化学方法是采用酶消化法，常用胰蛋白酶及胃蛋白酶，配制浓度与消化时间要适度。常用物理方法包括单纯加热、微波处理、高压加热。在选用加热法时，浸泡切片的缓冲液离子强度、pH值、加热温度、时间均影响抗原修复效果。
（六）免疫组织化学试剂的标准化
要求试剂公司提供标准化试剂，并附详细使用说明书，包括抗体来源、免疫球蛋白亚类、单抗或多抗、使用稀释度、使用流程及注意事项、洗涤时缓冲液的适宜离子强度和pH值等。抗体的选择和正确使用是开展免疫组织化学的首要环节之一。目前，抗体大部分来源于国外，抗体种类繁多、生产厂家各异，再经过中介渠道致有效期缩短，影响抗体效价甚至阳性不表达，因此对购入的抗体首先要进行检测。理想的抗体应具备特异性强、敏感性高、适应性强的特点。
1.抗体的选用
现市场销售的一抗多为即用型，但对于浓缩型一抗，则应通过预实验确定最佳工作滴度，抗体浓度过高或过低都可能出现阴性结果，应以适当稀释度得到最佳抗原染色强度和最低背景着色，灵敏度高而极易控制背景的检测系统试剂盒最为理想，也是免疫组织化学染色优劣的关键。免疫组织化学技术发展至今，第三代SP试剂盒更优于其他试剂盒 （ABC、PAP等，但应注意检测系统应与一抗来源相匹配。
一般情况下，多克隆抗体的抗原专一性较差、非特异性反应较明显、效价不太稳定，但制备简便、价格低廉、抗体效价较高、适应性强，稀释度一般在1∶（100～1000）之间。部分多克隆抗体表达抗原特异性较好，例如，TG、PSA等，多抗CD3对石蜡切片标记T淋巴细胞适应性强、阳性率高。单克隆抗体的抗原专一性强、质量和效价稳定、非特异性反应较少、标记结果可靠，但制备复杂、价格昂贵、抗体效价较低，稀释度在1∶（50～100）之间。目前市场上常有分装、稀释抗体出售，这种抗体使用经济，但稀释抗体减少了蛋白分子间互相保护的作用，因而效价不稳定、不易长期保存。进口试剂质量较好，但价格昂贵，特别是常用的第二抗体，染色过程短、敏感性高。因此，应根据实际需要选择合适的抗体。
2.抗体的分装
购入的抗体除非只够数次用量，一般要根据月需要量分装。除现用外，其余应立即置低温（-20℃以下）冰箱内贮存，即用即取，以免长期保存在4℃冰箱内失效。
3.抗体的稀释
按工作浓度稀释抗体，保存在4℃冰箱内的抗体尽量在1～2个月内用完，而不要放在冰箱的冰格中，因为抗体在0℃以下会很快冰冻，再次使用时需要融化，几次反复冻融会导致抗体效价急剧下降而失效。抗体稀释液在夏季温度较高时，最好加入少许防腐剂（叠氮钠、柳硫汞等），以免在切片上作用时间超过10h而致霉菌生长。
4.无菌与消毒
保持使用中的抗体无菌较困难，但与抗体接触的用具（滴管、吸管、试管、安瓿、加样器等）最好经过消毒，尽量减少污染机会，否则抗体极易因污染细菌与霉菌而迅速发生浑浊沉淀，导致试剂失效。
三、免疫荧光组化技术
（一）基本原理
根据抗原抗体反应原理，先将已知抗体标记荧光素制备荧光抗体，再以此作为探针与细胞或组织内相应抗原结合，在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上则含有标记的荧光素。利用荧光显微镜观察标本（荧光素受荧光显微镜激发光的照射而发出一定波长的荧光），从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。
（二）主要方法及基本步骤
主要包括直接法、间接法、补体法、双重免疫荧光标记法。
1.直接法
用荧光标记针对细胞或组织内抗原的特异性抗体（第一抗体），直接与标本进行染色反应，以检测标本中相应的抗原。主要特点为：操作简单、特异性高，但敏感性低，且由于一种荧光标记抗体只能检测一种特异性抗原，应用范围较窄。
2.间接法
先用针对细胞或组织内抗原的特异性抗体（第一抗体）与细胞标本反应，随后用缓冲液洗去未结合抗体，再用间接荧光抗体（第二抗体）与结合在抗原上的第一抗体（为第二抗体的抗原）结合，形成抗原-第一抗体-荧光第二抗体复合物。由于结合在抗原抗体复合物上的荧光抗体显著多于直接法，从而可提高检测敏感性。细胞抗原上每个分子结合3～5个分子抗体，当此抗体作为抗原时又可结合3～5个分子的荧光抗体，和直接法相比荧光亮度可增强3～4倍。主要特点为：特异性强、灵敏度高、应用更广，只需要制备荧光标记的羊抗鼠或羊抗兔第二抗体，即可应用于多种第一抗体的标记显示。
3.补体法
大多数抗原抗体复合物都能结合补体。因此，在染色时先将新鲜补体与第一抗体混合，同时加在抗原标本切片上，经37℃ 孵育后如发生特异抗原抗体反应，补体就结合在抗原抗体复合物上，再用抗补体荧光抗体与结合的补体反应，形成抗原-抗体-补体-荧光抗体复合物。主要特点为：只需一种荧光抗体，适用于各种不同种属来源的第一抗体的检测。
4.双重免疫荧光标记法
在同一细胞组织标本上需要同时检查两种抗原时需要进行双重荧光染色，一般均采用直接法。将两种荧光抗体（例如抗A和抗B）以适当比例混合，加在标本上孵育后，按直接法洗去未结合的荧光抗体，抗A抗体用异硫氰酸荧光素标记可发黄绿色荧光，抗B抗体用四甲基异硫氰酸罗达明荧光素标记可发红色荧光，以明确显示两种荧光抗原的定位。
四、免疫酶组织化学技术
（一）基本原理
先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶底物，生成有色不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。常用标记酶的种类主要有辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP、ALP、AP）、酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）、葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD）。
标记酶必须具备以下条件：①酶催化的底物必须是特异的，且容易被显示，所形成的产物易于光镜或电镜下观察；②所形成的终产物沉淀必须稳定，即终产物不能从酶活性部位向周围组织弥散，影响组织学定位；③获得的酶分子最好有商品出售；④中性pH值时酶稳定，酶标记抗体后活性不应改变，且酶活性越高越好；⑤酶标记过程中，酶与抗体连接不影响二者的活性；⑥被检测组织中，不应存在与标记酶相同的内源性酶。其中前两点最重要，HRP效果较佳，是最常用的一种标记酶。
（二）主要方法及基本步骤
主要方法包括直接法、间接法、补体法、免疫酶桥法、免疫酶双桥法、过氧化物酶抗过氧化物酶（PAP）法、双PAP法等。
1.直接法
用酶直接标记在特异性一抗上，与标本中的抗原结合，让酶催化底物反应产生有色产物，沉淀在抗原抗体反应部位，即可在镜下对标本中的抗原进行检测。优点是简便、快速、特异；缺点是敏感性差，标记一种抗体只能检测一种抗原，应用受限。
2.间接法
先用未标记的特异性一抗与标本中相应抗原结合，再与酶标记的抗球蛋白抗体（二抗）结合，然后再加酶底物显示抗原-抗体-抗抗体复合物存在的部位，以对抗原进行检测。提高了敏感性，而且用一种酶标记一种抗体就可检测多种抗原，较直接法使用广，但较费时、非特异性染色较多。
3.非酶标记的抗体酶法
在酶标记抗体过程中，酶与抗体的化学反应交联过程可影响酶活性和抗体效价，同时产生非特异酶标记抗体，可增加非特异性背景染色。为了避免上述缺点，相继发展了免疫酶桥法和PAP法，以酶为抗原免疫动物，产生抗酶抗体，通过酶与抗体的特异性结合进行标记，属于非酶标记的抗体酶法。
（1）免疫酶桥法 先用酶作为抗原免疫动物，制备效价高、特异性强的抗酶抗体；然后以二抗为桥梁，将在组织中与抗原结合的一抗与酶抗体连接起来，再将酶结合在抗酶抗体上，经酶底物显示出抗原分布。在此过程中，任何抗体均未被酶标记，酶是通过免疫学原理与抗酶抗体结合，避免了共价连接对抗体和酶活性的损害，提高了敏感性，又能节省第一抗体用量。但最大的缺点是抗酶抗体必须高度纯化，因为抗酶抗体中非特异性抗体不能与酶结合，但能与抗酶抗体竞争桥抗体的结合位点，从而减少抗酶抗体的结合，而大幅度降低呈色能力。另外，抗酶抗体的酶结合是低亲和力的，冲洗时易丢失而降低其敏感性。
（2）PAP法 与酶桥法相似，都是借助桥抗体将酶连接在组织抗原结合的第一抗体上，所不同的是先将抗酶抗体与酶结合制成酶-抗酶复合物（PAP），PAP复合物中的抗酶抗体和第一抗体为同种属动物的IgG，因此桥抗体能够作为“桥”将PAP复合物连接在第一抗体上。PAP复合物是离体制备的HRP抗HRP复合物，为五边形环状结构，极为稳定，冲洗时酶分子不会脱落，从而大大提高了PAP法的灵敏度，比免疫荧光法敏感100～1000倍，比酶桥法灵敏20倍。虽然灵敏度高、PAP背景染色低，但制备较复杂。