第二节　免疫印迹技术

一、概述

（一）免疫印迹技术的概念与基本原理

免疫印迹（immunoblotting）又称蛋白质印迹（western blot），是根据抗原抗体特异性结合检测复杂样品中某种蛋白的方法，是在SDS-PAGE凝胶电泳与固相免疫测定技术基础上发展起来的免疫生化技术。由于免疫印迹具有 SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的常规技术。免疫印迹常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析；结合化学发光检测，可以同时比较多个样品同种蛋白的表达量差异。

其基本原理为：强阴离子去污剂SDS与还原剂并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）时，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。经PAGE分离的蛋白质样品转移至固相载体（例如：硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与相应抗体发生免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

（二）免疫印迹法的优点

①固定化基质膜湿润柔韧， 易于操作；

②固定化的生物大分子可均一地与各种免疫探针接近， 不会像凝胶那样受孔径阻隔；

③免疫印迹分析只需少量试剂；

④孵育、洗涤时间明显减短；

⑤可同时制作多个拷贝， 用于多种抗原、抗体蛋白的分析和鉴定；

⑥结果以图谱形式可长期保存；

⑦可通过降低pH值等方法，将探针抹掉， 再换用第二探针进行分析检测。

二、免疫印迹的关键技术

免疫印迹法的关键技术包括电转移、封闭、免疫结合反应、检测等。

（一）电转移

根据电转移（亦称电转印）方式不同，常用的印迹法包括点印迹、扩散印迹、溶剂流印迹、电泳印迹。目前，最广泛使用的是半干式电转印，即在电场作用下将凝胶上的蛋白转移至转移液浸湿的膜上。电转印速度快、转移效率高，条件容易控制、重复性好，可保持胶的分辨率。

（二）封闭

蛋白质分子从胶上转移至膜上，为减少探针的非特异结合，用非反应活性分子封阻转移膜上未吸附区域，以降低检测的背景信号。

（三）免疫结合反应

用目的蛋白的抗体与转移膜上的目的蛋白（靶蛋白）进行特异性免疫结合反应，再用标记过的二抗与膜上的一抗反应。

（四）检测

根据连接二抗标识物检出，例如：化学发光、显色、放射性同位素测定等，间接检测目的蛋白的存在。目前常用的检测方法是化学发光法，即结合在膜上的HRP标记抗体与荧光底物结合，经HRP酶化学氧化，产生激发态发光产物。