第二节 免疫细胞及其功能检测技术
一、淋巴细胞及其亚群的数量检测
淋巴细胞要进行进一步的分类和观察，包括对T淋巴细胞、B淋巴细胞和自然杀伤（NK）细胞及其细胞亚群的检测，实质是对相应的表面标志分子进行测定，据此可建立起相应的细胞计数方法，借以判断机体免疫功能。常用于鉴定和检测计数淋巴细胞的表面标志是分化抗原簇（cluster of differentiation，CD）。CD抗原的鉴定和检测依赖于其相应的单克隆抗体，将抗CD分子的单克隆抗体与酶或荧光素等物质结合，通过抗原抗体特异性结合反应，目的细胞群体结合上标记的抗CD抗体，通过加入底物或用荧光显微镜观察等手段，即可对目的细胞进行计数，从而对其数量进行检测。
（一）检测方法
1.酶免疫组织化学法
以酶作为抗体标志物，采用细胞酶免疫组织化学技术，亦可采用生物素-链霉素亲和素放大系统提高检测灵敏度。该方法可用普通显微镜和图像分析系统进行观察，凡着色的细胞即为相应CD抗原阳性细胞，即可计算出阳性细胞占总细胞的百分率。
2.荧光免疫组织化学法
以荧光素作为抗体标志物，与待测细胞反应后，借助荧光显微镜观察，凡携带荧光素的细胞即为相应CD抗原阳性细胞，即可计算出阳性细胞占总细胞的百分率。
3.流式细胞仪分析法
受检者细胞或外周抗凝血与特定荧光标记的抗相应CD分子单克隆抗体反应后，将红细胞裂解，洗涤数次后可用流式细胞仪获取数据，经统计软件分析后可直接得出淋巴细胞及其亚群的绝对数及百分率。
（二）临床意义
1.T淋巴细胞
CD3为所有T细胞的特有标志，CD4是辅助性T细胞的标志，CD8是细胞毒性T细胞或抑制性T细胞的标志。
（1）CD4+淋巴细胞减少 可见于巨细胞病毒感染、慢性活动性肝炎、恶性肿瘤、遗传性免疫缺陷病、艾滋病、应用免疫抑制剂的患者。CD4绝对值变化可用于艾滋病患者的免疫状态分析、疗效观察及预后判断。
（2）CD8+淋巴细胞增多 可见于传染性单核细胞增多症急性期、艾滋病初期、慢性活动性肝炎、肿瘤、病毒感染、自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮等。
（3）CD4+/CD8+值异常
①比值降低：可见于系统性红斑狼疮肾病、传染性单核细胞增多症、急性巨细胞病毒感染、骨髓移植恢复期等。艾滋病患者比值显著降低，多在0.5以下。
②比值增高：可见于肺腺癌、扁平上皮癌、类风湿关节炎、1型糖尿病等。若移植后CD4+/CD8+比值较移植前明显增加，则可能发生排斥反应。
2.B淋巴细胞
CD19为B细胞共有的表面标志。CD19阳性细胞增多，提示B细胞增殖增加，常见于B细胞恶性增殖性疾病、自身免疫性疾病，例如：急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、系统性红斑狼疮等。CD19阳性细胞降低主要见于体液免疫缺陷病，例如：严重联合免疫缺陷病、性联丙种球蛋白缺乏症等。
3.NK细胞
NK细胞分子标志为CD16、CD56，表达于大多数NK细胞表面。NK细胞活性可作为判断机体抗肿瘤、抗病毒感染指标之一。NK细胞数量升高可见于宿主抗移植物反应者；NK细胞数量降低可见于血液系统肿瘤、实体瘤、免疫缺陷病、艾滋病、某些病毒感染患者。子宫及蜕膜中亦可见NK样细胞，且随妊娠期动态变化，病理性妊娠患者可出现显著异常。
二、淋巴细胞功能检测
（一）T细胞功能检测
淋巴细胞功能测定可分为体内试验、体外试验。体内试验主要是进行迟发型超敏反应，间接反映T细胞功能状况；体外试验主要包括淋巴细胞增殖试验、细胞毒试验、激活的淋巴细胞分泌细胞因子能力测定。
1.T细胞增殖试验
检测T淋巴细胞增殖反应的试验主要有形态学检查法、3H-TdR掺入法、MTT比色法三种。
（1）形态学检查法 将待检单细胞悬液与适量植物血凝素（PHA）或其他丝裂原物质混合，置37℃培养72h。取培养细胞作涂片染色，光学显微镜下观察，计数发生转化的淋巴细胞，每份标本计数200个细胞，计算淋巴细胞转化率。转化率在一定程度上可反映细胞免疫功能，正常人T淋巴细胞转化率为60%～80%，小于50%可视为降低。
（2）3H-TdR掺入法 在有丝分裂原或抗原刺激下，T淋巴细胞在转化为淋巴母细胞的过程中，DNA合成明显增加，且其转化程度与DNA合成呈正相关。在终止培养前8～16h，若将3H标记的胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）加入到培养液中，可被转化的淋巴细胞摄取并参与DNA的新合成。培养结束后，用液体闪烁仪测定淋巴细胞内放射性核素量，记录每分钟脉冲数（cpm），计算刺激指数（simulating index，SI），判断淋巴细胞的转化程度。
（3）MTT比色法 MTT是一种噻唑盐，化学名为3-（4，5-二甲基-2-噻唑）-2，5-二苯基溴化四唑。将淋巴细胞与丝裂原共同培养，在细胞培养终止前数小时加入MTT，混匀继续培养，MTT作为细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶的底物参与反应，形成蓝黑色甲
颗粒，并沉积于细胞内或细胞周围。甲可被随后加入的盐酸异二丙醇或二甲基亚砜完全溶解，用酶标测定仪测定细胞培养物的A570nm值。因甲的生成量与细胞增殖水平呈正相关，故样品的A570nm值可反映细胞增殖水平，以A570nm值及刺激指数（SI）可判断淋巴细胞增殖程度。
2.T细胞介导的细胞毒试验
淋巴细胞介导的细胞毒性是细胞毒性T细胞（CTL）的特性。细胞毒性T细胞经抗原刺激后，可特异性杀伤具有相应抗原的靶细胞（靶细胞与待检T细胞MHC应一致），表现出对靶细胞的破坏性溶解作用。
（1）形态学检查法 待检细胞毒性T细胞与相应靶细胞（常为肿瘤细胞）混合共同孵育后，细胞涂片瑞氏染色，显微镜计数残留肿瘤细胞数，通过计算细胞毒性T细胞对肿瘤细胞生长的抑制率，判断效应细胞杀伤活性。
（2）51Cr释放法 用N
CrO4标记靶细胞，若待检细胞毒性T细胞能杀伤靶细胞，则51Cr从靶细胞内释放出来（或标记于细胞膜表面的51Cr由于细胞膜破碎而悬浮于培养基中），用γ计数仪测定靶细胞释放的51Cr放射活性。靶细胞溶解破坏越多，51Cr释放越多，上清液的放射活性越强，通过计算51Cr特异释放率，判断淋巴细胞杀伤活性。
（3）细胞增殖评价法 用于细胞增殖的评价实验也可用于评价细胞被杀伤情况，3H-TdR掺入法、MTT比色法等用于评价细胞增殖的实验，通过与对照组比较也可较好反映实验组细胞死亡情况。
3.T细胞分泌功能检测
分泌各类细胞因子和生物活性物质是T淋巴细胞的重要功能。测定体外培养的T淋巴细胞经各种丝裂原或抗原刺激后所分泌的各种细胞因子，可以反映T淋巴细胞功能。可借助免疫学、细胞生物学及分子生物学技术分别检测细胞因子含量、生物学活性或基因表达水平，具体内容见第一篇第一章第五节。
4.体内试验
正常机体对某种抗原建立了细胞免疫之后，用相同抗原做皮肤试验时，常出现阳性的迟发型超敏反应。体内试验可检查受试者是否对某种抗原具有特异性细胞免疫应答能力，而且可以检查受试者总体细胞免疫状态，目前常用于诊断某些病原微生物感染（结核、麻风等）和细胞免疫缺陷等疾病，也常用于观察细胞免疫功能在治疗过程中的变化及判断预后等。
（1）特异性抗原皮肤试验 常用结核菌素做皮肤试验，将定量旧结核菌素（OT）注射至受试者前臂皮内，24～48h局部出现红肿硬结，以硬结直径>0.5cm者为阳性反应。其他还包括白色念珠菌素、皮肤毛癣菌素、腮腺炎病毒等皮肤试验。若受试者从未接触过该抗原，则不会出现阳性反应，因此阴性者也不一定表明细胞免疫功能低下。一般需用两种以上抗原进行皮肤试验，综合判断结果。
（2）PHA皮肤试验 将定量PHA注射到受试者前臂皮内，可非特异性刺激T淋巴细胞发生母细胞转化，呈现以单个核细胞浸润为主的炎性反应。一般在注射6～12h局部出现红斑和硬结，24～48h达高峰。通常以硬结直径>15mm者为阳性反应。PHA皮肤试验敏感性高、安全可靠，临床常用于检测机体细胞免疫水平。
（二）B细胞功能检测
B淋巴细胞主要产生Ig参与机体体液免疫应答，B淋巴细胞功能低下或缺乏者对外源性抗原刺激的应答能力减弱或缺陷，特异性抗体产生减少或缺如。B淋巴细胞功能检测主要包括受试者血清Ig含量检测、体外B淋巴细胞增殖、产生抗体能力检测等。
1.血清Ig含量检测
B淋巴细胞功能减低或缺陷可表现为血清Ig含量下降或缺如，因此可通过检测血清IgG、IgM、IgA含量判断受检者体内B淋巴细胞的功能，常用速率散射免疫比浊法。
血清中特异性Ig含量的检测对于评价机体B淋巴细胞功能具有更大的意义。将适量特异性抗原经皮下或肌内注射免疫受检者，于免疫前及免疫后1周、2周、3周分别采血，分离血清，测定受检者免疫前后特异性抗体效价，可判断受检者体内B淋巴细胞功能。
2.B细胞增殖功能检测
检测方法与T淋巴细胞增殖试验相同，但刺激物不同，小鼠B细胞可用细菌脂多糖（LPS）作为刺激物，人则用含SPA的金黄色葡萄球菌菌体及抗IgM抗体等作为刺激物。
3.B细胞分泌抗体功能检测
（1）溶血空斑试验 将绵羊红细胞（SRBC）免疫的小鼠脾脏（或家兔淋巴结）制成单个细胞悬液，与SRBC在琼脂糖凝胶内混合后倾注于小平皿或玻片上。脾细胞中的抗体生成细胞释放抗SRBC抗体，使其周围的SRBC致敏，在补体参与下可将SRBC溶解，形成肉眼可见的溶血空斑。每一个空斑中央含一个抗体形成细胞，空斑数目即为抗体形成细胞数，空斑大小表示抗体形成细胞产生抗体的多少。
（2）酶联免疫斑点试验 是一种既可检测抗体分泌细胞，又可检测抗体分泌量的方法。用抗原包被固相载体，加入待检的抗体产生细胞，即可诱导抗体分泌。分泌的抗体与包被抗原结合，在抗体分泌细胞周围形成抗原抗体复合物，使细胞吸附于载体上，加入酶标记的第二抗体与细胞上的抗体结合，通过底物显色反应的深浅，可测定出生成的抗体量，并可在镜下计数着色的斑点形成细胞。
（三）NK细胞活性检测
NK细胞具有细胞介导的细胞毒作用，能直接杀伤靶细胞。体外检测NK细胞活性的方法有形态学法、酶释放法、放射性核素释放法、化学发光法、流式细胞术法等。
1.形态学法
以人单个核细胞或小鼠脾细胞作为效应细胞，与靶细胞按一定比例混合温育，用台盼蓝或伊红Y等活细胞拒染的染料处理，光镜下观察着染的死亡细胞，计算出靶细胞的死亡率即为NK细胞活性。
2.酶释放法
乳酸脱氢酶（LDH）是活细胞胞质内酶类之一，正常情况下不能透过细胞膜。当靶细胞受到效应细胞攻击而损伤时，细胞膜通透性改变，LDH从胞质中释出。测定培养液中的LDH即可得知NK细胞杀伤靶细胞的活性。
3.放射性核素释放法
应用放射性核素51Cr或125I-UdR标记靶细胞，当靶细胞受到NK细胞攻击后，靶细胞被破坏，释放出放射性核素，通过测定上清和细胞部分的放射性强度可以计算出NK细胞活性。
三、吞噬细胞功能检测
吞噬细胞是指中性粒细胞、巨噬细胞、单核细胞等具有吞噬功能的细胞，吞噬运动大致分为趋化、吞噬、胞内杀伤作用三个阶段，可分别对这三个阶段进行功能检测。
（一）中性粒细胞功能检测
1.趋化功能检测
在趋化因子吸引下，中性粒细胞向趋化因子做定向移动。通过观察中性粒细胞的运动情况可判断其趋化功能。
（1）滤膜渗透法（Boyden小室法） 在上室加入待测细胞，下室加入趋化因子，上下室用一定孔径的微孔滤膜隔开。白细胞受趋化因子吸引，从上室穿过滤膜进入下室。取滤膜清洗、固定、染色和透明，在高倍镜下观察细胞穿越滤膜的移动距离，从而判断其趋化作用。本法还可用于检测淋巴细胞和其他细胞的趋化功能。
（2）琼脂糖平板法 在琼脂糖凝胶上打孔，加入趋化因子，根据中性粒细胞在琼脂糖凝胶中移动的距离，即可判定其趋化能力。
2.吞噬和杀菌功能测定
（1）显微镜检查法 将白细胞与葡萄球菌或白色念珠菌悬液混合温育，涂片、固定、碱性亚甲蓝染色。油镜下观察靶细胞对细菌的吞噬情况，计数吞噬细菌和未吞噬细菌的白细胞数，计算吞噬率。还可根据被吞噬的细菌是否着色测定杀菌率。
（2）溶菌法 将白细胞悬液与经新鲜人血清调理过的细菌（大肠埃希菌或金黄色葡萄球菌）按一定比例混合、温育。每隔一定时间取定量培养物（白细胞悬液），稀释后接种固体平板培养基作定量培养。37℃培养18h后，计数生长菌落数，以了解中性粒细胞的杀菌能力。
（3）硝基蓝四氮唑（NBT）还原试验 中性粒细胞在吞噬杀菌过程中，能量消耗剧增，耗氧量也随之相应增加，磷酸己糖旁路的代谢活性增强，6-磷酸葡萄糖脱氢酶使葡萄糖的中间代谢产物6-磷酸葡萄糖氧化脱氢转变为戊糖。若加入硝基蓝四氮唑，则可被吞噬或渗透至中性粒细胞胞质中，接受脱氢，使原来呈淡黄色的NBT还原成点状或块状的蓝黑色甲颗粒，沉积于中性粒细胞胞质中，称NBT阳性细胞。NBT阳性细胞百分率可反映中性粒细胞杀菌功能。慢性肉芽肿病患者NBT阳性细胞百分率显著降低，甚至为零。
（二）巨噬细胞功能检测
人体巨噬细胞待检标本很难获得，必要时采用斑蝥敷贴法收集人巨噬细胞，该法对人体局部有一定损害，不易接受。由实验动物所获得的巨噬细胞待检标本的巨噬细胞功能检测可参考中性粒细胞功能检测方法检测。巨噬细胞富含溶酶体酶，如酸性磷酸酶、非特异性酯酶和溶菌酶等，测定这些酶的活性也可建立相应的检测方法，分别为酸性磷酸酶法、非特异性酯酶法和溶菌酶法。
也可采用巨噬细胞促凝血活性法。激活的巨噬细胞可产生一种与膜结合的凝血活性因子，加速正常血浆凝固。取37℃预温的正常兔血浆和CaCl2混合液，加入经黏附获取单层巨噬细胞的试管中，移置37℃即时记录血浆凝固时间。实验证明，当巨噬细胞与脂多糖（LPS）、肿瘤相关抗原或乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）等温育后，血浆凝固时间明显缩短，此为巨噬细胞促凝血活性法。