第三章 分子免疫学检测技术
第一节 免疫沉淀技术
一、概述
(一)免疫沉淀的概念及基本原理
免疫沉淀是利用抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。其基本原理是基于抗原与抗体的高亲和力特性,用抗体结合并纯化溶液中的目标分子。抗原与抗体形成复合物后,即可利用琼脂糖微球链接的蛋白质A或蛋白质G将该复合物附着于琼脂糖微球上,通过离心即可将复合物分离出来。对于含量极少的蛋白,免疫沉淀是一项很有效的纯化技术,可使目标蛋白纯化一万倍以上,再经过SDS-PAGE分离,使原本很难检测的蛋白能够被检测到。
(二)免疫沉淀的分类
该技术现已广泛应用于基因、蛋白质及其相互作用等研究领域,按应用范围可分为以下四类。
1.免疫沉淀(individual protein immunoprecipitation,IP)
利用抗体特异性从细胞裂解物或其他可溶性生物样品中纯化已知特定蛋白质。IP与SDS-PAGE方法联用时,可达到测量蛋白质分子量、对已知抗原定量、确定蛋白质降解速率等目的。
2.免疫共沉淀(protein complex immunoprecipitation,Co-IP)
利用抗体沉淀相应特定抗原,同时沉淀与该抗原相互结合的其他分子,主要用于研究蛋白质相互作用。Co-IP与WB或质谱方法结合,可用于确定特定蛋白-兴趣蛋白在天然状态下的结合情况,确定特定蛋白质的新作用搭档。
3.染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP)
在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物,并将其随机切断,通过免疫沉淀复合体特异性富集目的蛋白结合的DNA片段,再通过对DNA片段的纯化和检测,获得蛋白质与DNA相互作用的信息。ChIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用,还可用于研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达间的关系。将ChIP与基因芯片相结合形成的ChIP-on-chip方法,可用于特定反式因子靶基因的高通量筛选;ChIP与体内足迹法相结合,可用于寻找反式因子的体内结合位点。
4.RNA免疫沉淀(RNA immunoprecipitation,RIP)
其原理与ChIP相近,但RNA免疫沉淀是用来研究与蛋白质结合的RNA在基因表达调控中的作用的。
二、免疫沉淀的关键技术
每种免疫沉淀方法都有一套固定的操作程序,但都是以抗原抗体特异性结合为基础。目前常规操作是利用共价结合蛋白A或蛋白G的琼脂糖或磁性微球将反应后的抗原抗体复合物富集纯化。蛋白A和蛋白G能与抗体保守区Fc段特异性结合,形成稳定的抗原抗体复合物附着在微球上,溶液内无关分子可通过洗涤微球被清除。最后,再采用一系列方法分析纯化抗原或与抗原结合的其他分子。整个过程中值得注意的几个关键影响因素如下。
(一)样品处理的质量
免疫沉淀实验成功的关键在于第一步样品处理。免疫沉淀实验本质是处于天然构象状态的抗原和抗体之间的反应,而样品处理的质量决定抗原抗体反应中抗原丰度及抗原构象状态等抗原质量。
样品处理应根据抗原样品的来源,例如:组织样品、细胞或其他形式的样品,选择适当方式进行细胞或组织破碎,使待检抗原释放至样品溶液中。裂解缓冲液的使用应注意添加合适的蛋白酶抑制,避免抗原或抗原-其他分子复合物被降解;另外,应选用去垢剂强度合适的裂解液,既保证有效裂解细胞释放抗原,又不破坏蛋白质之间的相互作用。
(二)抗体的选择
在考虑抗体特异性的同时,还需考虑抗体对抗原的亲和力。例如:单克隆抗体只对抗原的单一表位具有良好的特异性,因此在免疫沉淀中如果抗原表位暴露不充分、受到破坏,或受其他因素影响造成抗体不能识别抗原,无法有效形成免疫沉淀复合物,则将直接影响免疫沉淀结果。而多克隆抗体或混合单克隆抗体可以和抗原多个表位结合,从而解决亲和力的问题。但是,并不是所有抗体都能用于免疫沉淀,应选用经IP实验验证后的抗体以确保实验结果的可靠性。此外,不同类型、同类不同亚型的抗体对蛋白 A或G的亲和力不同,应选择合适的抗体及微球用于免疫沉淀。
(三)微球的选择
目前广泛应用于免疫沉淀的微球以结合了蛋白 A或G的琼脂糖和磁性微球为主,可沉淀通过抗原抗体反应形成的DNA-蛋白质-抗体复合物,特异性富集与目的蛋白结合的DNA片段;再经过多次洗涤,除去非特异结合的染色质后,用SDS+NaHCO3洗脱免疫沉淀复合物。
琼脂糖材料是无色透明、粒径达微米级、具有多孔表面的微球,表面积巨大、蛋白结合量高,曾一度成为免疫沉淀技术中的主要材料。但在免疫沉淀操作中需要采用离心的方法达到固液分离的目的,而反复离心产生的物理应力极易破坏蛋白的天然构象及完整性,且由于琼脂糖本身易破碎、不易保存,限制了琼脂糖微球在免疫沉淀中的发展。
相比之下,磁性微球核心为超顺磁性粒子,核心外层包裹高分子材料,表面平滑、粒径可达纳米级、比表面积大、单位质量的微球蛋白结合量更大。超顺磁性微球可在外加磁场中表现磁性,实现快速有效分离,大大缩短实验操作时间,温和的磁性分离方式避免反复离心对蛋白天然构象及完整性的破坏;在增大机械强度和稳定性的同时,缩减了产品造价。上述优势使超顺磁性微球成为免疫沉淀试剂盒行业的新秀,逐渐被研究者所采用。
三、染色质免疫共沉淀技术
(一)技术原理
在生理状态下把细胞内DNA与蛋白质交联,通过超声或酶处理将染色质切为小片段后,利用抗原抗体特异性识别反应,将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来。染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定、染色质断裂、染色质免疫沉淀、交联反应逆转、DNA纯化、DNA鉴定等主要步骤。由于实验涉及步骤多,结果的重复性较低,所以对染色质免疫共沉淀技术(ChIP)实验过程的每一步都应设计相应对照。
(二)主要技术关键
1.细胞固定
甲醛能有效使蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-RNA交联形成生物复合体,防止细胞内组分的重新分布。甲醛的交联反应是完全可逆的,便于在后续步骤中对DNA和蛋白质进行分析。交联所用的甲醛终浓度为1%,交联时间通常为5min至1h,具体时间根据实验而确定。交联时间过长,细胞染色质难以用超声波破碎,影响ChIP结果。
2.染色质断裂
交联后的染色质可被超声波或Micrococcal Nuclease切成400~600bp的片段(用琼脂糖凝胶电泳检测),以暴露目标蛋白,利于抗体识别。未经过甲醛固定的样品,超声波处理会打断蛋白与DNA的结合,所以只能选择酶处理染色质的方法。对于甲醛固定的样品,一般选择超声波处理方法,也可使用酶处理方法研究甲醛固定较温和的样品。
超声波是使用机械力断裂染色质,容易引起升温或产生泡沫,都会引起蛋白质变性,进而影响ChIP效率。所以用超声波断裂染色质时要在冰上进行,且要设计时断时续的超声程序,保证持续低温。另外,超声探头要尽量深入管中,但不接触管底或侧壁,以免产生泡沫;总超声时间不要太长,以免蛋白降解。Micrococcal Nuclease可将染色质切成一至几个核小体,比超声波处理结果更精致、更均一。另外,酶反应条件比较温和,对DNA和DNA-蛋白复合物的损伤较小,而且蛋白不易变性。因此,酶处理染色质适用于新鲜细胞或组织样品和冰冻样品。
3.抗体-agarose beads孵育
裂解细胞、离心并去除不可溶的膜组分后,上清可储存于-80°保存3个月,但最好能够使用新鲜制备的细胞裂解液上清进行抗体-agarose beads孵育实验。抗体可先加入上清中,与样品孵育数小时后再加入蛋白A或者G beads孵育过夜,也可以同时加入抗体和蛋白A或者G beads孵育过夜。一般1mg总蛋白(1mg/mL)对应添加1μg抗体,最高可添加至5μg抗体,过多的抗体会产生假阳性结果。
此步骤中关键因素在于选择合适的阴性对照。一般选用加同样量IgG,但更为妥当的方法是选择针对胞内其他无关目的蛋白的一抗做对照。例如:做膜蛋白A的免疫沉淀,选择膜蛋白B做阴性对照,只要确认二者之间没有相互作用即可;而做胞质可溶性蛋白C的免疫沉淀,则选择另外一个可溶性蛋白D来做阴性对照。同时,为避免蛋白A或者G beads有(非)特异性吸附,从而造成免疫沉淀实验结果的假阳性,一般在加入目的蛋白抗体之前,预先将蛋白 A或者G beads与细胞裂解液孵育数小时,然后取上清用于后续的抗体-agarose beads孵育。
同时,蛋白 A或者G beads对不同类型的抗体亲和力不同,考虑一抗的种属和Ig亚型,选择合适的蛋白A或者G beads也是决定免疫沉淀实验成功与否的一个重要因素。一般推荐使用蛋白 A和G beads混合物,可达到最佳实验效果,而且省去了许多选择的困扰。
4.抗体-agarose beads复合物洗涤
除选择特异性好的抗体以及选择合适的阴性对照外,去除免疫沉淀实验非特异性的一个办法是对抗体-agarose beads复合物进行多次洗涤。一般洗涤缓冲液使用和裂解液一样的配方,但需去除甘油,以减少由于甘油的黏性带来的非特异性吸附。针对不同的实验要求,还可通过更改NaCl浓度以及去垢剂比例、种类来达到去除非特异性吸附的效果。例如,针对单纯的免疫沉淀而非免疫共沉淀实验,或者虽然是进行免疫共沉淀实验,但蛋白质之间的结合比较牢靠,可考虑使用低浓度SDS(0.2%~0.5%)洗涤抗体-agarose beads复合物,这样可以去除绝大部分非特异性相互作用。
(三)染色质免疫沉淀中的对照与抗体选择
1.Input对照
在进行免疫沉淀前,需要取一部分断裂后的染色质做Input对照。Input是断裂后的基因组DNA,需要与沉淀后的样品DNA一起经过逆转交联、DNA纯化,以及最后的PCR或其他方法检测。Input对照不仅可以验证染色质断裂的效果,还可以根据Input中的靶序列的含量以及染色质沉淀中靶序列的含量,按照取样比例换算出ChIP效率,因此Input对照是ChIP实验必不可少的步骤。
2.抗体选择
染色质免疫沉淀所选择的目的蛋白抗体是ChIP实验成功的关键。因为在蛋白质与染色质交联结合时,抗体的抗原表位可能因为与结合位点的距离太近,不能被抗体识别,而不能有效地在体内形成免疫沉淀复合物,直接影响ChIP结果。只有经过ChIP实验验证后的抗体才能确保实验结果的可靠性。
3.阳性与阴性对照
阳性抗体和阴性抗体对照是最基本的实验对照。阳性抗体通常选择与已知序列相结合的比较保守的蛋白的抗体,常用的包括组蛋白抗体或RNA 聚合酶Ⅱ抗体等。阴性抗体通常选择目的蛋白抗体宿主的IgG或血清。目的蛋白抗体的结果与阳性抗体和阴性抗体的结果相比较,才能得出正确结论。另外,还应考虑目的蛋白抗体与DNA的非特异性结合可能,所以通常还会选择一阴性对照引物,即目的蛋白肯定不会结合的DNA序列,作为该抗体的阴性对照。最佳的阴性对照引物是在靶序列上游的一段与目的蛋白肯定不能结合的序列。如果目的蛋白没有商品化的适用于染色质免疫沉淀实验的抗体,只有其他用途的抗体时,可以先做蛋白质免疫沉淀(immunoprecipitation)检测;如果抗体可以成功沉淀蛋白,再进行染色质免疫沉淀实验检测。