第二章　细胞免疫学检测技术

第一节　免疫细胞分离技术

一、外周血单个核细胞的分离提取

外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形态和相对密度与外周血中其他细胞均不同。外周血中的红细胞和多形核白细胞相对密度在1.092左右，较单个核细胞的相对密度（1.075～1.090）为大。因此利用一种相对密度在1.075～1.090之间的介质，可使外周血中的各种细胞成分按照相对密度的不同而在这种介质中重新分布，从而达到分离单个核细胞的目的。为使分离速度加快，一般要进行离心。Ficoll分离液主要用于分离外周血中的单个核细胞，可用于单次差速密度梯度离心分离法，分离人外周血淋巴细胞以相对密度1.077±0.001的Ficoll分离液最佳。

二、免疫细胞的分离提取

（一）外周血总淋巴细胞的纯化分离

根据密度梯度离心法分离得到的PBMC悬液中含有高浓度的淋巴细胞（淋巴细胞占90%～95%），因此PBMC有时也可代表淋巴细胞而直接用于某些实验，但对于某些要求较为严格的实验，则必须去除单核细胞，获得更高纯度的淋巴细胞。

1.贴壁黏附法

利用单核细胞有贴壁生长的特点，将已制备的PBMC悬液倾于玻璃或塑料平皿或扁平培养瓶中，置37℃恒温箱静置1h，单核细胞和少许粒细胞将贴附于平皿壁上，而未贴壁的细胞几乎为纯淋巴细胞。

2.吸附柱过滤法

将PBMC悬液注入装有玻璃纤维或葡聚糖凝胶Sephadex G10的色谱柱中，凡有黏附能力的细胞绝大部分被吸附而黏滞在柱层中，从柱上洗脱下来的细胞主要是淋巴细胞。

3.Percoll 分离液法

Percoll是一种经聚乙烯吡咯烷酮（PVP）处理的硅胶颗粒，对细胞无毒性。Percoll液经高速离心后可形成一个连续的密度梯度，不同密度的细胞将悬浮于各自不同的密度区带，从而将密度不等的细胞分离纯化。

4.磁铁吸引法

利用单核细胞具有吞噬的特性，在PBMC悬液中加入直径为3μm的羰基铁颗粒，置于37℃恒温箱内不时旋转摇动，待单核细胞充分吞噬铁颗粒后，将磁铁置于管底，单核细胞将被吸引，上层液中即为纯度较高的淋巴细胞。

（二）各类免疫细胞及细胞亚群的分离提取

自体液、组织中收集获取的单细胞悬液，可根据细胞的不同特征性标志分子选择性纯化所需细胞。凡根据细胞的标志分子进行选择性纯化得到所需要的细胞的方法，称为阳性选择法；而选择性去除不需要的细胞，以提取所需要的细胞的方法，称为阴性选择法。

1.免疫磁珠分离法

细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单克隆抗体相结合，借助于抗体磁珠与相应细胞结合形成细胞-抗体-磁珠复合物。在外加磁场作用下，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中，未携带相应表面抗原的细胞由于不能与连接磁珠的特异性单克隆抗体结合而没有磁性，不在磁场中停留，从而使所需细胞得以分离提纯。可以直接用磁铁吸附阳性细胞进行细胞分离，即淘洗法。

2.流式细胞仪分选法

荧光激活细胞分离是分选型流式细胞仪的主要功能之一，是先进和有效的细胞分离方法。