2.5　病毒的培养和计数

2.5.1　病毒的培养特征

（1）病毒在液体培养基中的培养特征　将噬菌体的敏感宿主细胞在液体培养基中先进行培养，敏感细菌会均匀分布在液体培养基中，使培养基出现浑浊。当接种噬菌体后，敏感细菌被感染后发生裂解，原来浑浊的细菌悬浊液因此而变得透明。

（2） 病毒在固体培养基中的培养特征　将噬菌体的敏感细胞接种在琼脂固体培养基上，形成菌落。当噬菌体被接种后，会在感染点上进行反复感染，导致细菌菌落中的细菌被裂解而出现空斑，这些空斑称为噬菌斑（plague）。

2.5.2　病毒的培养基

由于病毒的专性寄生的习性，所以其培养也较为困难，必须提供活的敏感细胞，而且要求它能提供病毒附着的受体，不对侵入的病毒核酸进行破坏（没有破坏特异性病毒的限制性核酸内切酶）。

不同种类的病毒，其培养基是不同的。

脊椎动物的病毒敏感细胞有人胚组织细胞、人体组织细胞、肿瘤细胞、动物组织细胞、鸡鸭胚细胞，也可以用敏感动物（如猴、兔、羊、马、小白鼠等）来培养病毒。不同病毒对组织的敏感性不一样，如脊髓灰质炎病毒对人胚肾细胞最敏感，乙型脑炎病毒对鸭胚肌皮细胞及猪肾细胞最敏感。

植物病毒的培养可用相应的敏感植物或植物组织细胞进行。

噬菌体的培养，要求提供与之相应的敏感细菌，如大肠杆菌噬菌体就需要用大肠杆菌（Escherichia coli）来培养。

2.5.3　动物病毒的空斑实验

动物病毒的培养可分为动物接种、鸡胚接种和组织培养技术。其中组织培养技术受到广泛的应用。

首先要进行动物细胞的培养，将动物病毒的敏感细胞按照一定的方法，经过培养后制成单层细胞的培养基。然后用采集的病毒样品进行接种感染。经适当时间的孵育培养，结果在单层细胞的表面出现空斑。以出现的空斑数来判断单位体积中所含的病毒数η_PFU。

所谓空斑是指原代或传代单层细胞被病毒感染后，一个个细胞被病毒侵蚀而形成的空斑（或称蚀斑）。一个空斑表示一个病毒。所以，通过病毒空斑单位的计数可以求出环境样品中存在的病毒数量。

在病毒计数时，还常用到一个概念——病毒的滴度。所谓病毒的滴度是指能产生培养管中50% CPE（细胞病理效应）的最高病毒稀释度（即最少的病毒量），称为TCLD₅₀（组织培养感染剂量）。若是敏感动物，则用ID₅₀（使50%感染动物发生变化的感染剂量）或LD₅₀（使50%敏感动物死亡的致死剂量）来表示病毒的滴度。

2.5.4　噬菌体的培养和测定

由于细菌的培养相对比较简单，所以噬菌体的培养相对也比较简单。

1mL培养液中含有的活噬菌体的数目称为噬菌体的效价。常用双层琼脂法来测定（滴定）噬菌体的效价，在实验的前一天在灭菌的培养皿内倒入约10mL适合某种宿主细菌生长的琼脂培养基，待凝固成平板后置于一定温度的培养箱内烘干平板上的水分，取2～3滴宿主菌（每毫升含10⁸个细菌）加入软琼脂培养基（融化并冷却到45℃）中，再加入0.1mL噬菌体样品，摇动混匀后全部倒入平板，使之铺满这个平板，凝固后，在一定温度下倒置培养一定时间后，在平板上会出现噬菌斑，可以根据噬菌斑的数目计算出原液中噬菌体的数量（效价）。双层琼脂法见图2-6。

图2-6　双层琼脂法