摘要：既往数据显示，2015年的全球新发结核病人数1040万，死亡人数140万，与上一年度相比发病数和死亡数都有所上升。结核病发病和死亡人数的增多使得对于结核病疫苗，特别是效力更好的结核病疫苗的需求更加迫切。目前共有13个结核病疫苗正在进行临床试验，其中有4个病毒载体疫苗（Ad5Ag85A、ChAdOx1.85、MVA85A、TB/TLU-04L），4个重组亚单位疫苗（H1/H56、H4、ID93、M72），2个非结核分枝杆菌疫苗（DAR-901、Vaccae），1个重组结核分枝杆菌疫苗（MTBVAC），1个重组BCG疫苗（VPM1002），1个结核分枝杆菌提取物疫苗（RUTI）。然而临床期的疫苗能否达到预期的保护效力仍有很大的不确定性。随着新的生物学技术的出现，将来会有越来越多的新免疫原被发现，而从中选择最优的免疫原或免疫原组合，并基于这些免疫原及时开发新的结核病疫苗，并尽快完成临床前研究至临床试验评估，才能更好地满足目前临床需求。通过不断推出新的候选结核病疫苗，有望加快结核病疫苗的开发进程，早日实现通过疫苗控制结核病的目标。

关键词：结核病疫苗；重组亚单位疫苗；BCG；安全性；效力；免疫原

2016年我国科研工作者主要评估了重组亚单位疫苗WH121/DMT、AEC/BC02，重组BCG疫苗rBCG-BE1726D、微卡疫苗的安全性和效力，并系统性地评估了不同遗传谱系的BCG菌株疫苗毒力及效力，以及对结核病疫苗新抗原靶标Rv3400进行了研究和探讨。

具有疫苗潜力的结核分枝杆菌保护性抗原仍然是研究重点。Ma等 ^［1］选择5个结核菌不同阶段特征性表达的蛋白（Ag85A、PhoY2、Rv3407、Rv2626c、RpfB）构建了融合蛋白，并制备了亚单位疫苗WH121/DMT。WH121/DMT疫苗组与各单组分抗原疫苗组相比具有更好免疫原性和保护力。WH121/DMT疫苗接种C57BL/6小鼠在免疫9周和18周后，每只小鼠80个CFU的毒性结核分枝杆菌H37Rv感染，WH121/DM疫苗组与BCG保护力相当（肺脾组织载菌量及肺组织病变水平相当）。小鼠BCG免疫后用结核菌感染，再次用WH121/DMT和BCG分别免疫，WH121比BCG重复接种更能显著地抑制脾中结核菌的生长，甚至有4/6的小鼠脾中没有检测结核菌。WH121/DMT引起的保护主要由于WH121特异性Th1型免疫应答，包括高水平的抗原特异性IgG2a/IgG1比值和高水平的IFN-g。这些研究结果表明多级特异性抗原可能是下一代结核疫苗的希望，但这些抗原组合的疫苗仍需要进一步临床前评估。

脂阿拉伯甘露聚糖（LAM）抗原是一种存在于结核杆菌细胞壁上的脂多糖，它能从代谢活跃或老化的结核分枝杆菌中释放出来并且仅存在于活动性结核病人体内。Sun等 ^［2］阐述了单一ssDNA适配体结合到BCG上甘露糖包被的脂阿拉伯甘露聚糖后，增强了抗结核的免疫保护作用。文章选择特异性结合BCG的甘露糖包被的脂阿拉伯甘露聚糖（ManLAM）的ssDNA适配体“抗体”BM2，利用BM2显著阻断ManLAM-甘露糖受体（MR）结合，触发ManLAM-CD44信号传导，并在体外和体内通过细胞表面CD44增强M1巨噬细胞和Th1活化。BM2增强小鼠和猴模型中BCG对毒性结核分枝杆菌H37Rv感染的免疫保护作用。报告了ManLAM和CD44在巨噬细胞和CD4 ⁺T细胞之间相互作用的新机制，并揭示与ManLAM结合的膜分子CD44是增强BCG免疫原性的新靶标，并且BM2具有作为BCG免疫增强剂的潜力。

重组结核疫苗AEC/BC02作为潜伏性结核感染（LTBI）人群的候选疫苗，由结核分枝杆菌抗原Ag85B、ESAT6-CFP10和复合佐剂BC02构成。卢锦标等 ^［3］对结核分枝杆菌感染豚鼠接种重组结核疫苗AEC/BC02后的超敏反应（Koch现象）进行研究，通过脏器病变和细菌载量分析、肺部炎症评估，结果显示，与接种H37Ra灭活全菌体后可产生较为明显的超敏反应相比，重组结核疫苗AEC/BC02诱发超敏反应的风险较低。豚鼠感染结核分枝杆菌（5.0×10 ³ CFU/只），40天后平均分成3组，每组6只，分别经AEC/BC02疫苗和H37Ra菌体免疫3针，肝、脾、肺脏器的病变程度均有所减轻，其中H37Ra组综合评分（48±26）低于生理盐水组（62±15），差异无统计学意义。AEC/BC02组（36±15）与生理盐水组比较，差异有统计学意义。AEC/BC02组与H37Ra组比差异无统计学意义。尽管AEC/BC02疫苗组脏器综合病变程度较轻，但脾和肺脏的活菌计数结果显示，仅脾活菌数［（4.64±0.64）log10CFU］低于生理盐水组［（5.57±0.75）log10CFU］，差异有统计学意义，而两组肺活菌数比较差异无统计学意义；同时H37Ra组脾和肺的细菌载量也低于生理盐水组，但差异无统计学意义。AEC/BC02疫苗连续3针次免疫后没有观察到明显的超敏反应，HE染色呈弥散的炎症反应，肺部结构大体完整，炎症区域为18%而H37Ra组为33.6%。肺部炎症反应提示感染结核分枝杆菌的豚鼠接种H37Ra灭活全菌体后可产生较为明显的Koch反应，而重组AEC/BC02疫苗诱发Koch现象的风险较低，提示AEC/BC02疫苗对LTBI人群诱发超敏反应的风险较低。

李军丽等 ^［4］克隆表达并纯化了结核分枝杆菌多表位融合蛋白TP15，分别以MF59和hBCG单独或联合作为佐剂，并通过皮下或肌内注射BALB/c小鼠，采用间接ELISA法检测小鼠血清抗TP15特异性IgG、IgG1、IgG2a抗体，流式细胞术检测小鼠脾淋巴细胞多功能CD4 ⁺T细胞含量，夹心ELISA法检测小鼠腹腔巨噬细胞培养上清中的细胞因子IL-1β和IL-12的含量，分析了不同佐剂和免疫途径对TP15免疫原性的影响。结果显示MF59和hBCG单独或联合作为TP15抗原的佐剂，其免疫原性存在一定差异，但均优于无佐剂TP15。MF59+hBCG复合佐剂增强TP15抗原免疫反应的效果优于单一佐剂，诱导Th1型细胞免疫漂移，且皮下注射免疫效果优于肌内注射。

美国Aeras通过基因重组技术将5种结核杆菌免疫保护相关抗原Ag85B、ESAT-6、Rv1733c、Rv2626c和RpfD导入亲本株BCG中，构成rBCG-BE1726D。rBCG-BE1726D可表达Ag85B、ESAT-6、Rv262c三种蛋白，BCG-SSI菌株未检测ESAT-6、Rv262c抗原表达。张海峰等 ^［5］鉴定rBCG-BE1726D特异性蛋白的表达，并初步评价其在小鼠体内的免疫原性。通过皮下免疫BALB/c小鼠，分离脾淋巴细胞，ELISPOT及ELISA法检测IFN-γ的分泌水平高于BCG，但无统计学意义；流式细胞术检测CD4 ⁺、CD8 ⁺T细胞的比例，明显高于BCG组。结果表明rBCG-BE1726D免疫小鼠后可能以激活CD8 ⁺T细胞为主。rBCG-BE1726D菌株中分泌IFN-γ的淋巴细胞虽然高于BCG菌株，但无显著差异。因此，rBCG-BE1726D需要进一步证实其免疫原性。疫苗的最终保护效果必须依赖动物模型的攻毒保护性实验进行评价，所以，rBCG-BE1726D的实际保护力仍有待进一步研究。

母牛分枝杆菌菌苗微卡（M.vaccae）是目前唯一进入临床Ⅲ期的候选疫苗，由安徽龙科马生物制药有限公司研发。郭存炳 ^［6］通过对微卡治疗患者血清血管活性肠肽（VIP）、IL-17水平比较，分析发现微卡肌注治疗能明显降低耐多药性肺结核患者血清VIP、IL-17水平，具有很好的临床疗效。夏露等 ^［7］通过比较抗结核治疗组和微卡组患儿的治疗效果和不良反应，评价微卡在治疗卡介苗反应性淋巴结炎的临床效果。结果表明，抗结核治疗组100%（25/25）患儿淋巴结肿大均逐渐消退，微卡组95.5%（42/44）淋巴结肿大逐渐消退，两组有效率比较差异无统计学意义。抗结核药物治疗组16%（4/25）出现肝功能损伤，微卡组无患儿出现肝功能损伤，两组肝损伤发生率比较差异有统计学意义。采用微卡治疗卡介苗反应性淋巴结炎具有较好的效果，且可减少患儿不良反应的发生。该研究为治疗卡介苗反应性淋巴结炎提供参考依据。高德杰等 ^［8］通过分析微卡在预防性治疗LTBI中的细胞免疫学作用机制，随机选取2014年4月至2015年4月收治的LTBI患者120例，依据整群随机抽样的方法将患者分为微卡治疗组、化学治疗组和对照组，各40例，比对3组患者细胞免疫学指标水平变化。治疗后1个月微卡治疗组患者的CD3 ⁺CD4 ⁺、CD3 ⁺CD56 ⁺均显著高于对照组，化学治疗组患者的CD4 ⁺IFN-γ ⁺显著高于对照组。表明，微卡对于LTBI有预防性免疫治疗作用。

朱琳等 ^［9］克隆表达并纯化了结核亚单位疫苗Rv3400-IFA，结核亚单位疫苗Rv3400-IFA是一种由结核分枝杆菌抗原Rv3400联合弗氏不完全佐剂（incomplete Freund’s asjuvant，IFA）构成的新型疫苗；并且在C57BL/6小鼠体内评估Rv3400的免疫效应；在体外用抗原Rv3400感染巨噬细胞RAW264.7，每组5只，每2周1次，共免疫3次，评估其免疫应答，其中阴性对照为未刺激的巨噬细胞。结果显示，Rv3400-IFA免疫小鼠后，可产生较好的细胞免疫和体液免疫效应，以诱导小鼠持久Thl型免疫反应为主；体外细胞实验结果显示Rv3400抗原能促进细胞分泌高水平的IL-6和TNF-α，分别达到（49 217.0±390.61）pg/ml、（1783.4±51.18）pg/ml；阳性细胞比率分别由未刺激的（34.704±2.40）%、（31.254±18.31）%、（41.804±6.01）%和（44.30±0.44）%提高至1μg/ml Rv3400抗原刺激后的（90.45±7.71）%、（90.104±4.10）%、（89.97±7.79）%和（85.134±5.12）%，增加巨噬细胞表面分子CD40、CD80、CD86、MHCⅡ的表达，引发较强的免疫反应。免疫小鼠后，ELISPOT结果显示：实验组Rv3400组小鼠分泌IFN-γ的斑点形成细胞（136.20±95.09）显著高于阴性对照组（14.00±9.62），ELISA结果同样显示Rv3400组小鼠T细胞产生TNF-α和IFN-γ的水平明显高于阴性对照组。通过间接ELISA测定免疫后的小鼠血清抗体IgG效价水平高达1∶409 600，表明抗原Rv3400也能诱导有效的体液免疫应答；IgG2b/IgGl水平为1.8，说明抗原Rv3400诱导小鼠以Thl型免疫反应为主。Rv3400有望成为结核疫苗的候选抗原。

BCG从1924年在世界范围内开始推广使用，至今已经有超过40亿人接种。目前BCG是全球最为广泛使用的疫苗，每年接种剂量超过1.2亿剂。然而由于早期菌株保藏及传代不规范，使得不同国家使用的BCG菌株存在遗传因子和生化表型上的差异，不再是1921年时单一的菌株。世界范围内使用的十几株BCG菌株根据DU2遗传特点可以分为DU2Ⅰ、DU2Ⅱ、DU2Ⅲ、DU2Ⅳ四个遗传谱系。不同BCG菌株疫苗在不同国家或地区中的保护效果存在较大差异。

Zhang等 ^［10］将4个遗传谱系（DU2Ⅰ～Ⅳ）的13株BCG通过动物模型进行了系统的安全性和效力评估。13株BCG在重症联合免疫缺陷（SCID）小鼠中的安全性实验（每只小鼠按10 ⁷CFU BCG尾静脉感染，观察18周）结果表明，DU2Ⅳ组的BCG-Phipps、BCG-Frappier、BCG-Pasteur和BCG-Tice的毒力最高，SCID小鼠生存时间在10周左右，分别为48、53.5、55、58天；肺组织载菌量在接种后4周分别达到7.35log10、7.34log10、6.76log10、7.11log10，与接种后1周相比平均上升了2.5log10。BCG-China、BCG-Moreau、BCG-Russia和BCG-Danish的毒力水平中等，生存时间分别达到83、94.5、99.5、114天；肺组织载菌量在接种后4周与1周相比上升了1.2log10～2.1log10。BCG-Japan、BCG-Birkhaug、BCG-Sweden、BCG-Glaxo和BCGPrague的毒力最弱，在18周内生存率分别为93.75%、100%、100%、100%和100%；肺组织载菌量在接种后4周与1周相比平均仅上升了0.2log10。BCG-Pasteur、BCG-Russia菌株重复实验时，SCID小鼠生存时间分别达到了42、84天；BCG-Japan株18周结束时小鼠全部存活，与第一次实验结果一致。

13株BCG在BALB/c小鼠中的效力评估（每只小鼠按10 ⁶ CFU BCG皮下免疫，免疫后8周用100CFU H37Rv气溶胶感染，感染后4周、9周解剖检测）结果表明，感染后4周：BCG-Phipps、BCG-Frappier、BCG-Pasteur、BCG-Tice、BCG-Danish、BCG-Prague、BCG-Russia和BCG-Moreau免疫组与对照组相比肺组织载菌量下降显著，达到0.58log10～1.03log10；BCGChina、BCG-Glaxo、BCG-Japan、BCG-Birkhaug和BCG-Sweden免疫组肺组织载菌量下降与对照组相比无显著差异。BCG-Pasteur、BCG-Tice和BCG-Danish免疫组脾组织载菌量平均下降0.78log10，与对照组相比下降差异显著，其余BCG菌株脾组织载菌量下降与对照组相比无显著差异。感染后9周：13株BCG免疫组肺、脾平均载菌量为6.77log10和6.07log10与对照组肺载菌量6.65log10和脾载菌量5.89log10相比均无显著差异。综合安全性和效力实验结果发现，BCG菌株毒性与其保护效果存在相关性，显示出BCG菌株毒性越强保护性越好的趋势。本研究结果对于世界范围内如何选择最优的BCG菌株作为生产用疫苗菌株以及开发新的重组BCG疫苗时如何选择BCG母体菌株提供了重要的数据参考。

从细菌菌体中直接提取Ag85A蛋白易发生凝聚和降解且难以纯化。而对Ag85A进行原核表达及相关研究多以包涵体形式表达，因此限制了Ag85A的应用。徐正中等 ^［11］利用冷休克表达质粒和含有伴侣质粒的大肠杆菌对Ag85A蛋白进行可溶性表达并纯化鉴定，通过C57BL/6小鼠模型对Ag85A蛋白的免疫原性进行分析，该蛋白具有较好的免疫反应性。从而为其进一步免疫功能的研究及其应用奠定了基础。

应用分子生物学技术，王森林等 ^［12］将结核分枝杆菌抗原Hsp65、Esat6和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子hGM-CSF融合，构建plHsp65-Esat6GM共表达质粒，并在真核细胞HepG-2中表达。结核分枝杆菌热休克蛋白X（HspX）是第一个被证实在营养不足、缺氧状态和休眠期时表达的参与潜伏感染的蛋白，是维持其在巨噬细胞内生存的必需蛋白。张继明等 ^［13］构建HspX基因与EGFP融合基因的真核表达质粒pEGFP-N1-HspX，并在小鼠单核巨噬细胞RAW264.7中表达。王君等 ^［14］利用融合PCR技术，将PhoP、PhoR和PhoPR基因上、下游的同源臂与卡那霉素抗性基因融合，构建PhoP、PhoR和PhoPR突变片段，进而获得了结核分枝杆菌PhoPR双组分系统缺失突变载体，与传统方法相比，效率高、周期短。这些均为研制新型结核疫苗奠定了基础。

体内定植性是活菌疫苗研发必备的条件之一，柳小玲等 ^［15］观察了融合菌株B/R的生长特性及其在免疫小鼠体内的生长情况。B/R菌株由其实验室前期构建，融合了BCG和H37Ra菌株。结果显示与单独BCG或H37Ra相比，B/R菌株的定植能力较强，生长周期为30天，在小鼠体内至少存活2个月。这对B/R菌株作为结核候选疫苗具有参考作用，为研制新型结核疫苗奠定了基础。

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