摘要：结核分枝杆菌为结核病的病原菌，深入了解结核分枝杆菌的生理生化特性，是预防控制结核病的基础。近一年来，国内学者在结核分枝杆菌抗原的免疫原性及抗原表位、毒力因子、持留以及耐药等方面取得了不少研究成果。

关键词：结核分枝杆菌；免疫原性；抗原表位；毒力因子；持留感染；耐药

结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）为缓慢生长菌，有分枝生长的倾向，由于细胞壁内含有大量的分枝菌酸，包围在肽聚糖的外面，而具有抗酸染色特性。Mtb生理生化的特殊性，不仅使其在自然环境中具有较强的抵抗力，如在阴湿处能生存5个月以上；Mtb还能通过多种逃逸机制而抵抗宿主细胞的杀伤。由此可见，深入研究Mtb的生理生化特性，能为更好地理解结核病的发病机制和结核病的防控提供有利的基础。

Mtb生长早中期分泌到胞外的一类蛋白质称为分泌性蛋白，具有高度免疫原性和特异性，对分泌性蛋白研究较深入的是Esx-1分泌系中的6kD早期分泌抗原（ESAT-6）和早期滤液蛋白-10（CFP-10）。Esx-1底物蛋白Rv3615c是含有103个氨基酸的ESAT-6样蛋白，其N-末端的20个氨基酸在ESAT-6家族成员中相对保守，BLAST比对显示其序列与ESAT-6、CFP-10高度相似。为探究Rv3615c的免疫原性，许礼发等 ^［1］成功构建结核分枝杆菌Esx-1底物蛋白Rv3615c的原核表达质粒pET30b-Rv3615c。利用全血IFN-γ分析试验（WBIA）检测Rv3615c蛋白特异性刺激淮南市Mtb感染者淋巴细胞，发现IFN-γ浓度显著高于健康对照者。Rv3615c/SAS诱导小鼠产生的IgG、IgG1、IgG2a以及Rv3615/SAS诱导小鼠脾淋巴细胞分泌的特异性IFN-γ、TNF-α和IL-2，均显著高于PBS组和SAS组，显示rRv3615c具有较强的免疫原性，可诱导趋向于Th1型免疫应答。

Rv2660c编码的蛋白通过识别TLR2可激活巨噬细胞，从而刺激机体分泌IL-1β、IL-8、TNF-α和IL-12p70等促炎症因子，这些因子对肉芽肿的形成有重要作用，此外Rv2660c蛋白还能激活潜伏性感染结核者的细胞免疫和体液免疫，而关于Rv2660c蛋白应用于抗潜伏期结核的相关报道较少，缺乏Rv2660c蛋白的结构和免疫学特性的基础资料。蒋明娟等 ^［2］通过BLAST软件分析，发现Rv2660c蛋白与人类蛋白同源性不高，同源性最高的人类蛋白是MAD6蛋白，同源性仅为16%。进一步采用生物信息学方法预测，发现Rv2660c蛋白无跨膜区，为胞外蛋白，不含信号肽序列。此外，Rv2660c还含有丰富的B细胞和T细胞抗原表位，其中19-35、48-54、28-44和58-73位氨基酸残基可能存在优势线性B细胞表位；56-64和65-74位氨基酸可能存在优势辅助性T细胞表位，66-74、41-49、63-71位氨基酸可能存在优势细胞毒性T细胞表位，这些丰富抗原表位，有望作为潜伏性感染结核的治疗性疫苗和药物的作用靶点。

TB10.4又名culture filtrate protein-7（CFP-7），由结核分枝杆菌EsxH（Rv0288）基因编码表达。关于TB10.4的功能机制研究很少，仅知道其基因编码所在区esx-3与铁离子、锌离子的代谢有关。艾能等 ^［3］成功构建了真核表达质粒P VAX1-TB10.4和P VAX1-GFP-TB10.4。将重组质粒P VAX1-TB10.4免疫小鼠，该质粒能够诱导低水平的抗体应答，同时诱发IFN-γ表达，并且能够加强BCG初次免疫后的免疫应答效果，为后续TB10.4蛋白生物学功能研究提供良好的生物材料。

Rv2004c是与缺氧相关的Mtb潜伏感染相关抗原之一，是一种保守的假想蛋白。王东方等 ^［4］应用生物信息学技术对Rv2004c的表位进行预测和分析，发现该蛋白有10个候选B细胞抗原表位；37个候选Th细胞抗原表位，主要位于第200位氨基酸之后，其中HLADRB1*0401及HLA-DRB1*0701表型相对的表位数目较多，且某些候选表位的主要组织相容性复合体（MHC）限制类型存在交叉重叠；此外，该蛋白还有10个候选细胞毒性T淋巴细胞表位，其中以HLA-A2限制性表位数目较多、分值较高。

Rv2626c蛋白是感染Mtb后的休眠期受休眠调节因子DosR调控的特异性表达的48种蛋白之一，具有很强的免疫原性。其主要存在于感染Mtb后休眠期的细胞壁上，同时在菌体的培养液中也可以检测到。处于休眠期的Mtb感染者细胞壁上的Rv2626c蛋白会强烈地刺激机体T细胞的大量增殖，并大量释放IFN-γ和IL-2。为了研究Rv2626c与细胞凋亡的影响，孟露萍等 ^［5］通过构建慢病毒表达载体p LEX-EGFP-Rv2626c，感染RAW264.7细胞，证实Rv2626c高水平过表达可显著促进细胞的凋亡，为进一步揭示Mtb的致病机制奠定理论基础。

李江英等 ^［6］通过DNAStar软件预测结核分枝杆菌Rv3812蛋白的抗原表位，结果显示Rv3812蛋白具有丰富的二级结构和多处抗原指数较高的区段，共有8个潜在的B细胞抗原表位，该蛋白共有19个潜在的T细胞抗原表位，由此推测Rv3812是一个T细胞抗原表位占优势的蛋白抗原，B细胞抗原表位略少。

结核分枝杆菌ClpX（Rv2457c）属于AAA+ATP酶家族，具有底物识别以及ATP水解活性，可特异性地识别并解聚或重塑靶蛋白；也可与具蛋白水解酶活性的ClpP结合形成ClpXP异源二聚体，特异性地降解目的蛋白。ClpX是Mtb存活与致病所必需的，感染宿主后，ClpX下调自身细胞分裂蛋白FtsZ的活性，参与调控Mtb自身的细胞分裂。而作为细胞膜组分，ClpX可能是一种保守的毒力因子，参与Mtb与宿主的免疫互作。为了探索ClpX在感染宿主细胞过程中的作用机制，王亚倩等 ^［7］通过酵母双杂交技术在人类淋巴细胞cDNA文库中筛选得到了一个新的与ClpX相互作用的蛋白UBC9，并利用GSTpull-down和Co-IP技术证实了这两个蛋白在体外和体内相互作用的特异性。将ClpX转染HEK293T细胞过表达，RNA干扰与回复实验进一步证实了ClpX蛋白能够通过与UBC9的相互作用抑制宿主细胞增殖。

Mtb是一种包含大量毒素-抗毒素系统（toxin-antitoxin systems，TAS）的病原体，但是其中大部分TAS的功能作用尚不清楚。在对结核分枝杆菌毒素-抗毒素系统作用机制的研究中发现，higB蛋白具有核糖核酸内切酶的活性，可特异性切割菌体内的mRNA，若higB蛋白累积，可阻碍细胞生长中的转录过程，进而导致翻译过程被遏止，细菌因缺少生存所必需的蛋白质而死亡。董娜等 ^［8］采用PCR方法成功扩增Mtb H37Rv的higB基因，基因序列与GenBank上公布的Mtb标准株的核苷酸同源性为100%。运用生物信息学方法分析higB蛋白共125个氨基酸，分子质量单位为14.4298ku，理论等电点10.18，脂溶性系数77.36，不稳定系数35.67，预测该蛋白为稳定蛋白。higB蛋白无信号肽，其二级结构中β-转角占12%，无规则卷曲占34.4%，氨基酸序列中有3个潜在的B细胞抗原表位，4个Th细胞表位，5个磷酸化位点，这些结果为研究其生物学功能和免疫活性奠定了基础。

屈艳琳等 ^［9］成功构建了Mtb毒素-抗毒素系统中mazEF3基因的过表达菌株，并且电转电压在2300V时，构建的过表达菌株mazEF3 mRNA表达量最高，为进一步研究Mtb毒素-抗毒素系统的生物学作用奠定基础。

PhoPR双组分系统不仅是12个Mtb双组分系统之一，而且是最基本、最重要的双组分系统。它能够感受外界微环境的改变，并及时调控自身各系统，包括RD l区域基因的表达水平、ESAT-6的分泌等，从而调控Mtb脂质代谢等方面，使得其在宿主体内得以生存。为进一步研究Mtb PhoPR双组份系统的功能，王君等 ^［10］利用融合PCR和T载体克隆技术，成功获得Mtb的PhoP、PhoR和PhoPR缺失突变载体，为下一步构建Mtb突变株以及相关研究奠定基础。

异柠檬酸裂合酶（isocitrate Lyase，ICL）参与乙醛酸循环，是Mtb能在宿主体内潜伏的关键因素之一。为了研究ICL在Mtb持续感染宿主细胞过程中的作用机理，石超等 ^［11］以ICL为诱饵，通过酵母双杂交技术在人淋巴细胞cDNA文库中筛选得到一个新的ICL相互作用蛋白CTBP1（C terminal binding protein 1）。然后分别采用GST pull-down和Co-IP实验证实了这两个蛋白在体外和体内与ICL相互作用的特异性，通过使ICL在HEK293T细胞中过表达，发现内源性CTBP1在转录水平和蛋白水平的表达都受到了抑制，同时导致细胞增殖减缓、凋亡加快，并出现G2/M期阻滞等改变。这些结果表明，Mtb ICL在参与介导细胞凋亡、影响宿主细胞活性的过程中起着重要的作用。

Mtb对β-内酰胺类抗菌药物的固有耐药性限制了β-内酰胺类抗菌药物在结核治疗上的应用，而A类（Ambler分类）β-内酰胺酶BlaC的表达是Mtb对β-内酰胺类抗菌药物耐药的最主要原因，抑制BlaC则可恢复Mtb对于β-内酰胺类抗菌药物的敏感性。Liu等 ^［12］通过表达并纯化BlaC，构建了BlaC抑制剂的筛选模型，通过条件优化使该模型适用于高通量筛选，然后对26 400个化合物样品进行筛选，得到了22个BlaC抑制剂，这一研究为可用于临床的新型抗结核药物增效剂的发现奠定了基础。

Mtb rpoB基因编码RNA聚合酶的β-亚基，该基因的突变与利福平耐药相关。为了解rpoB基因突变特征与利福平耐药水平的关系，胡族琼等 ^［13］测定266株Mtb，包括109株利福平耐药株和157株利福平敏感株的利福平MIC值及其rpoB基因序列。发现109株利福平耐药株rpoB基因皆发生错义突变，常见突变密码子531与526的突变频率分别为69.7%与17.4%。利福平耐药株中单密码子突变株占82.6%，多重密码子突变株占17.4%。531单密码子突变株与526单密码子突变株之间平均利福平MIC值无差异，但多重密码子突变株平均利福平MIC值（115.8μg/ml）显著高于单密码子突变株平均利福平MIC值（48.4μg/ml）。5.5%的利福平耐药株仅在rpoB基因起始端发生突变，推测rpoB基因起始端突变可能是除利福平耐药决定区域之外导致利福平耐药的第2个耐药决定区。rpoB基因DNA序列分析有助于Mtb利福平耐药表型和耐药水平的预测。

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