第八节 血细胞染色体检查
血细胞染色体检查包括非显带技术、显带技术、染色体高分辨显带技术等。为了弥补显带技术的不足，20世纪80年代发展了荧光原位杂交技术，提高了检测范围及灵敏度;自动化染色体分析技术如多色FISH、光谱核型分析，提供了高效、快速且方便的手段，是复杂异常核型分析的有力手段;近几年应研究需要，又发展了多种针对不同部位的多色FISH。
一、染色体非显带技术
非显带染色体(non-banding chromosome)指未经显带的染色体，不呈现任何明显带纹，故无法确切分析每一条染色体。
人类有22对常染色体、一对性染色体。常染色体依照长度递减的顺序编为1～22号(21号染色体比22号短)，性染色体用X和Y表示。以有丝分裂中期最为典型，故染色体分析需获得足够的分裂中期细胞。
每条染色体由两条染色单体组成，联结两条单体的中间狭窄处，为着丝粒(也称主缢痕)，它将染色体分为短臂(p)和长臂(q)。按照染色体大小递减的顺序和着丝粒的位置，将其分为七个容易区别的染色体组(A～G)，详见表2-41。人类染色体分为中着丝粒、亚中着丝粒和近端着丝粒染色体等三种类型。有些近端着丝粒染色体的短臂可见一个球形的小体，中间以细丝与短臂相连，称随体;在单个细胞中，不是所有的D、G组短臂都显示随体，且随体的数目和大小是可变的。有些染色体长臂上还可见到较小的狭窄区，称为次缢痕。人体染色体模式详见图2-25。由于非显带染色体只能计数染色体数目异常而无法识别每条染色体，故临床已不用。
表2-41 人类正常的常染色体分组
注:*X染色体大小与C组相似，＊＊Y染色体大小与G组相似
二、染色体显带技术
显带染色体(banding chromosome)指经某种特殊处理或特异染色后，染色体上可显示出一系列连续的明暗带纹，这个明显和周围区别的区域，称为带。
【测定原理】
图2-25 人体染色体模式图
1970年后，相继出现了Q带、G带、R带、C带及高分辨等显带技术。前三者属于常规显带技术，在一套染色体中只能显示322条带;高分辨显带技术可使一套染色体的带纹数达到400条、800条甚至1000条。根据染色体上不同的带纹特征，可以清楚地识别每一条染色体及其片段。临床常用的是G显带、R显带和高分辨显带技术，各种技术特点详见表2-42。
表2-42 三种常用染色体显带技术的特点
续表
【标本要求】
白血病的染色体标本通常以骨髓为宜，采集2～4ml，以肝素抗凝使其终浓度为6. 4IU/ml，接种到1640培养液，以(6～8)×106/ml细胞密度为准。当外周血白细胞计数＞10×109/ml，原始及幼稚细胞＞10%时，也可用外周血进行细胞培养。标本如不能及时送检，不能存放冰箱，可放于室温或37℃孵箱，但不宜超过10小时。
【结果报告及解读】
人类染色体的国际命名法，最早始于1960年的“丹佛提议”，名称为“关于人类有丝分裂中染色体命名标准系统的提议”，从此，人类细胞学国际命名体制不断地丰富并发展为更科学、精确的体制。最新的人类染色体命名体制(ISCN，2009)，详尽描述了人类染色体的核型、异常的类型及规范统一的书写形式，包括分子生物学方面的规范表达形式。
显带染色体上的明暗条纹称为带(band)，染色体臂的末端、着丝粒和某些特殊的带称为界标(landmark)，两个界标之间的区域称为染色体区(region)。区的划分是以着丝粒开始向短臂(p)或长臂(q)的臂端延伸，依次编为1区、2区、3区等，用作界标的带就是该区的1号带。在表示一个指定带时需要四项内容，即染色体号、臂号、区号和带号，如1p11指1号染色体短臂、1区1带，1q41-4指1号染色体长臂、4区1至4带，详见图2-25。如果一个带需要再分，就称为亚带(subband)，如6p23. 1指6号染色体短臂、2区3带的第1亚带。
对每份标本进行核型分析时，至少需分析20个中期分裂象，并报告分析结果。核型异常指克隆性异常，克隆性异常指来源于一个祖代细胞的细胞群，至少≥2个细胞有相同或类似的染色体异常，或≥3个细胞有相同的染色体丢失。正常人R显带特点见图2-26。
图2-26 正常人染色体R显带特点(46，XY)
报告染色体结果时先写染色体总数，然后列出性染色体，继之常染色体异常按从小到大的顺序列出，同一条染色体先列出数目异常，后列出结构异常。如有来源不明的环状染色体(r)、无法识别发生重排的染色体各部分来源的标记染色体(mar)和双微体(dmin)时，列于最后，顺序依次为+ r、+ mar、+ dmin。一个患者同时有正常核型和异常核型存在时，正常核型列于异常核型之后。染色体异常的定义及其报告方式详见表2-43，在表2-44中列举了各种异常(abn)核型的报告方式及文字解读。骨髓移植的继发嵌合中，首先列出受体细胞克隆，随后是供体细胞，连着用双斜线(/ /)分开，例如46，Y［3］/ /46，XX［17］。
表2-43 染色体异常的定义及报告方式
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注:括号内为简单的文字解读
表2-44 列举各种染色体异常核型的报告方式及解读
【临床意义】
2008年WHO分型中以遗传学变化、分子学突变、基因表达及临床作为依据进行危险分层、评估预后。将急性白血病分为几个类别:伴重现性遗传学异常、治疗相关性及形态学等，把对血液病的研究视线带入了微观的基因领域。伴重现性遗传学异常的AML及B-ALL详见第七章第一节表7-4，急性白血病遗传学预后因素详见表2-45，表中的对手基因(partner)是指一种基因可以分别和多个不同的基因形成融合基因的一种基因。染色体核型分析已成为白血病患者不可缺少的常规手段。白血病患者血液学缓解期间，其异常核型减少或消失，复发时再现或出现新的异常，为白血病患者的进一步研究提供了有价值的线索。
表2-45 急性白血病WHO分型中的遗传学预后因素(2008年)
【应用评价】
R和G显带，R带末端多深染，而G带末端多为浅染。由于白血病、肿瘤等恶性疾病的染色体异常末端缺失或易位较多见，因此，恶性疾病的遗传学分析常用R显带;遗传性疾病的细胞遗传学分析常用G显带。
染色体显带反映了调节DNA复制、修复、转录和遗传重组的基因组功能结构。这些带容量很大，每带含5～10Mb的DNA，包含数百个基因。
高分辨显带技术可使单套染色体的带纹数达到800条或1000条，用于特殊研究，能检出DNA3～5Mb的结构异常。G、R显带技术难以肉眼观察到4Mb以下异常，一种新的FISH技术弥补了传统染色体显带技术的不足。
三、荧光原位杂交技术
【测定原理】
荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)技术的基本原理是:将生物素或地高辛荧光标记的特异性DNA探针，与靶细胞染色体进行杂交后(即变性、退火及复性)，通过荧光显微镜观察荧光信号、进行分析。FISH技术中所用的探针标记分为:直接标记和间接标记。直接标记指用荧光染料或放射性核素直接标记探针，当探针与靶核苷酸结合后可直接显色、显影;间接标记是指借助于不受杂交条件影响的稳定标记物结合探针，要求标记物可被特异性抗体结合，制备生物素化探针。非放射性核素间接标记方法有三种:生物素标记、地高辛标记及辣根过氧化物酶(HRP)标记。FISH常用探针类型的特点及临床意义详见表2-46。
【标本要求】
同染色体核型分析，核型分析剩余细胞悬液放置在－20℃，FISH分析临用前取出。
表2-46 FISH常用探针类型的特点及临床意义
续表
【结果报告及解读】
间期FISH分析需在荧光显微镜下计数200个细胞，计算阳性百分率、报告结果。多色FISH至少需采集10个分裂象，利用图像分析系统准确报告。间期FISH检测融合基因一般采用双色双融合探针，分别为红、绿色，正常细胞为2红、2绿(因为每个细胞有一对同源染色体)，当两者融合时呈黄色或红绿叠加色。观察时红色或绿色会呈现2～3个紧挨着相同颜色点，这时需要比对其他细胞，辨认其为一个点或多个点。如果断裂发生，通常红色、绿色间距较远。在检测某个基因是否有断裂重排时，如CMYC和IGH基因，采用断裂点两侧双色标记探针，红色、绿色融合呈现黄色，为基因正常;红色、绿色分离，为基因重排阳性。
异常核型描述同表2-43、表2-44，例举FISH见图2-27～图2-29，FISH检测的报告单样本见图2-30。
图2-27 IgH基因重排阳性图(间期FISH)
绿色代表IgH基因可变区基因，红色代表IgH恒定区基因。图中a 与b为正常细胞，为2黄色(即红、绿色融合) ;图中c与d有1黄1绿1红，1绿1红为IgH基因重排导致红、绿色分离
图2-28 PML-RARα融合基因阳性图(间期FISH)
绿色代表正常的PML基因，红色代表正常的RARα基因，黄色(即红、绿色融合)为PML/RARα融合基因阳性，图中a与b均有2个黄色
图2-29 P53基因扩增及1q21扩增图(间期FISH)
红色代表1q21，绿色代表p53，正常细胞应2红2绿。该患者左边细胞中8红、3绿，为1q21和p53扩增;右边细胞中6红、2绿，为1q21扩增而p53正常
【临床意义】
1.用重复序列探针可测定白血病染色体数目异常，如12三体的间期FISH可见一个细胞内三个荧光点。位点特异性探针可用于结构异常测定，如del (13) (q14. 3)的间期FISH可见一个细胞内一个荧光点。
2.间期FISH能够测定对白血病具有诊断意义的融合基因，如BCR-ABL、PML-RARα、AML1-ETO、TEL-AML1等测定。
3.可用于扩增基因的测定，如MYCN癌基因高度扩增为神经母细胞瘤的特征表现，MYCN癌基因扩增时，间期细胞可见多个荧光点。
4.可分析无中期分裂象细胞和终末分化细胞的遗传学特征。
5.FISH技术可对白血病治疗后微小残留病进行监测，白血病达到完全缓解后，体内仍残留微量白血病细胞，具有高灵敏度的FISH技术可测定到常规R显带正常核型患者中残存的异常细胞，预示疾病复发的可能性。
图2-30 FISH检测的报告单
6.作为骨髓移植成功的指标，如慢性髓细胞白血病患者骨髓移植成功，费城染色体消失。对于性别非原配移植，间期FISH测定供、受者性染色体阳性率，判断移植是否成功及骨髓移植后骨髓细胞的来源。
7.鉴别标志染色体(marker)的特征，如M-FISH可区分marker的来源。
【应用评价】
断裂点分开的双色探针假阳性率低，可以独立于对手基因，即在对手基因不固定情况下测定易位的发生，优越于两种基因融合的测定方法，如MLL基因(对手基因64种之多)、11p15的NUP98基因(对手基因28种左右)、12 p13的TEL基因(对手基因34种之多)等测定。这些基因发生的重排、易位累及近端粒的微小片段，常规显带方法易漏检，FISH方法具有明显的优越性。
间期FISH技术极大促进了对非任意易位、缺失和涉及白血病相关基因的测定。间期FISH最大优点是能够对非分裂间期细胞进行分析。当不能确定异常发生的区域，需结合常规细胞遗传学方法和多色FISH或SKY。多色FISH或SKY可以测定24条染色体数目异常、一部分结构重排、复杂易位、较大的缺失和隐匿易位。对于涉及端粒区域较小片段的异常，多色FISH易漏检，如t (5; 11) (q35; p15. 5)易位，用M-TEL能够检出此类异常。
FISH技术由于其直观、快速、敏感性高和方便灵活而越来越得到广泛应用，尤其是在血液学领域中。因为白血病标本较易取得和制备，不同类型的白血病常常有其特异的染色体异常，FISH在白血病诊断、治疗监测、预后估计和微小残留病测定等诸方面都正成为不可缺少的重要手段。FISH技术本身也在新的需求下不断更新和完善。
(李倩)