第九节　流式细胞术检查

流式细胞术(flow cytometry，FCM)检查是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的新型分析技术和分选技术。其特点为:①测量速度快，最快可在1秒内检测数万个细胞;②进行多参数测量，可对同一个细胞做有关物理、化学特性的多参数测量，并可用于统计学分析;③是一门综合性的高科技方法，它综合了激光技术、计算机技术、流体力学、细胞化学、图像技术等多领域的知识和成果;④既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。根据流式细胞仪的性能分为分析型及分选分析型，前者多为台式机，后者多为大型机。

【测定原理】

标本与荧光素标记的单克隆抗体或与有特殊亲和力的荧光染料结合后，制定成一定浓度细胞悬液，放入流式细胞仪的样品管中，细胞在气体压力作用下进入充满鞘液的流动室内，在鞘液约束下细胞排列成单列，并从流动室的喷嘴高速喷出成为细胞液柱。细胞液柱与入射激光束垂直相交，相交点为测量区。通过测量区的细胞被激光照射后产生散射光并发出荧光，散射光和荧光穿过滤光片，被光电倍增管或二极管接收并转换为电信号，这些信号通过加工处理并储存在计算机中，由专门的软件对这些数据进行图像显示、分析而获得检测的结果。流式细胞仪主要由三部分组成:液流系统、光学系统及电子系统。

1.液流系统

依次传送待测样本中的细胞到激光照射区。标本上机检测之前需将合适的荧光素标记单抗(一种或多种荧光单抗)与标本孵育反应，然后用溶解素去除标本中的红细胞。为了分析结果可靠，标本必须要求是单个分散的细胞悬液。等张的鞘液在一定压力下进入流动的管道，并将压力传递给流动的细胞，使细胞始终成一行，保证以单个细胞的形式逐个通过测量光束。中心轴流的速度是由鞘液压力来控制，轴流的直径则由鞘液压力和单位体积的标本传递率两者来控制。分辨率和敏感度就是依赖于这两种参数，控制它们对于良好的分析结果极为重要。根据上述简单的原理可以得出:在保持鞘液压力不变时，增加标本传递率，就增加中心轴流直径，导致分辨率下降;在保持标本传递率不变时，增加鞘液压力，导致标本流速增加，使敏感度下降。

2.光学系统

细胞被激光激发，通过光学滤片产生光信号，并传送到相应的探测器。激光是细胞微弱荧光快速分析的理想光源，这是因为由于细胞的快速流动，每个细胞经过光照区的时间仅为微秒左右，细胞必须达到足够的光照强度，使每个细胞所携带荧光物质被激发出来。因此，要保证样品中每个细胞受到一样的光照，而激光就能提供单波长、高强度及稳定性高的光照。仪器的敏感度和分辨率还依赖于激光束的形状和强度，何时及如何改变这些参数是根据标本检测要求来决定的。

(1)光散射:

激光在细胞上的反射和折射就产生了光散射，见图2-31A。沿着光束轴向一致称为前散射(forward scatter，FSC或FS)，一般介于1°～10°，与细胞的体积大小成比例，在区分细胞与细胞碎片之间FSC非常有用;较大角度的光散射称为侧散射(side scatter，SSC或SS)，是由细胞内部结构反射而形成的，与细胞内的颗粒特性相关。根据不同细胞的体积和颗粒性，光散射(FSC和SSC)的二维散点图可将外周血细胞分成三大群:淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞，详见图2-31B。

(2)多色荧光:

不同的荧光素有不同的激发波长(光吸收)和发射波长(光发射)，常用的荧光素包括异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)、藻红蛋白-德州红偶联物(ECD)、别藻青蛋白(APC)、多甲藻叶绿素蛋白(PerCP)及藻红蛋白偶联物(PeCy)等，详见表2-47及图2-32。常用荧光素中以PE最强，使用于弱表达抗原; FITC最便宜，使用于强表达抗原。荧光染色分为直接、间接免疫荧光法，临床多用直接法，即用荧光素标记的单抗染色细胞或测其荧光强度和阳性细胞。多色分析时还应进行色彩补偿，以避免多色荧光间信号的相互干扰。

流式细胞仪通常有两种类型的激光源，第一种是氩离子激光，发射光波长为488nm (蓝色到蓝绿色)，能激发多种常用的荧光素和染料;第二种激光包括了氩-氖激光、氦-镉激光和红色二极管激光，发射波长分别为633nm、325nm和634nm。采用荧光素的荧光波长要长于激发光波长，才能将两者区开来。流式细胞仪中滤光片的作用是分离不同光谱的光，并收集能用的光谱成分，用于定量各自的荧光。滤光片有两种类型:①吸收滤光片:将不需要的光谱过滤掉，而让需要的光谱通过滤片;②干扰滤光片:削弱或反射不需要的光谱。

3.电子系统

把光信号转换为电信号。传感器的作用就是将光子转化为电子脉冲，电子脉冲的强度与光子的数量成正比，也与结合到细胞表面的荧光素分子的数量成正比，详见图2-33。

电脉冲通常都很弱，必须要将其放大(线性或对数级放大)。仪器通过转化器将电脉冲(模拟信号)转化为数字信号。数字信号可以直方图形式或列表模式贮存。当以直方图形式贮存时，横坐标(X轴)代表了预先指定的参数(例如荧光强度)，纵坐标(Y轴)代表被分析细胞的数量。FCM的一大优点是通过软件可重新处理及分析数据，尤其在复杂标本中各细胞群之间有很大差异性时。

【标本要求】

1.标本种类

用于流式细胞仪测定的常用标本为外周血和骨髓液(建议用EDTA-K2抗凝剂)，但流式细胞仪测定的标本类型并没有严格限制，只要能制备成单细胞悬液的标本(例如淋巴结、实质器官的活检标本和体液等)都可以用于流式细胞仪测定，白血病分型一般采集骨髓液。

2.标本量

对于一般性的流式细胞仪检测，如白血病免疫分型、淋巴细胞免疫分型、骨髓/外周血CD34+细胞计数等，标本只需1～2ml就足够，如果患者有严重的血细胞减少，必须适当增加采集标本量。

3.送检时间

流式细胞仪的检测标本必须是新鲜的活体细胞或组织，经过化学固定的标本，由于细胞已死亡，不宜用流式细胞仪测定。对于无菌的外周血和骨髓液，原则上放置时间不应超过12小时;对于活体实质组织标本，采集后应尽快送实验室。有时为了防止标本干燥，可添加少量生理盐水，但一定不能用甲醛溶液或乙醇固定。如果能快速送检，标本不需无菌，但装载标本的容器必须干净，无肉眼可见的颗粒存在。

【单抗选择】

白血病等免疫分型时，先做一线单抗用于筛选细胞系列，每个系列的单抗中应至少含一个高特异性CD、一个高敏感性CD，详见表2-48。表中MPO (髓细胞)、血型GPA (红系)、CD41/CD42/CD61 (巨系)、CyCD22 (B细胞系)、CyCD3 (T细胞系)等为系列特异性抗原;非系列特异性的免疫学标志包括CD34、HLA-DR及TdT，为早期阶段细胞表达抗原。2008年WHO分型对细胞系列确定有了新标准，详见表2-49，基本确定髓、T及B细胞系后再结合二线单抗进行亚型分析。

同时也需有阳性对照、阴性对照及同型对照。阳性及阴性对照主要用于验证试验结果的可靠性，例如CD3可作为T淋巴细胞的阳性对照，NK细胞可作为CD3、CD19的阴性对照;同型对照是指在含正常血细胞中加入与细胞单克隆抗体特异性无关的CD。检测细胞数的总数一般为20 000～30 000个，但目的细胞数应＞2000个，否则影响精密度。

【设门】

流式细胞仪技术中一个很重要的步骤就是选择某一细胞群进行分析，这种方法称为“设门”(gating)。设门策略对流式细胞仪技术分析极其重要，直接关系到结果的精确性，而某些相对简单的设门可由计算机软件自动完成。

急性白血病的免疫分型需结合抗原表达类型及表达程度。通过正确设门，分离到需分析的异常细胞，分离到的细胞应尽可能纯，无关细胞掺杂越多，检测的结果可靠性越差。目前CD45-SS双参数设门已成为白血病、淋巴瘤等免疫分型的最佳设门策略，可以有效地鉴别异常与正常细胞群。CD45是一种在多种白细胞表面均表达的荧光抗体(又称全白细胞抗原)，其表达强度随细胞成熟逐渐增强，CD45的表达水平在不同系列也均有所不同，淋巴细胞＞单核细胞＞粒细胞＞原始及幼稚细胞，而红细胞及血小板呈阴性。SS值为一个光散射参数，与细胞颗粒、核形有关，故以粒细胞最大，单核细胞居中，淋巴细胞最小，而原始细胞、幼稚淋巴细胞及幼稚单核细胞的SS值与淋巴细胞相似，幼稚粒细胞与成熟粒细胞相似。

因此，CD45联合SS (即CD45-SS双参数设门)，可以将骨髓标本分为以下四个群:粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、原始及幼稚细胞，详见图2-34。以CD45-SS设门时，以SS值为横坐标，以每个细胞CD45的强度为纵坐标(反之也可)，简单分析该直方图，可大致判断标本是否正常。如再结合其他CD进行多色分析，则很容易识别非正常细胞群的表型。

【结果报告及解读】

临床结果的报告单样本详见(图2-35、图2-36，见文末插页)，报告多以二维散点图来表示，图中每个点代表一个细胞信号，若两个细胞在同一位置则相互重叠。在CD45-SS设门图中，可将所有有核细胞分为以下细胞亚群(用不同颜色来表示) :淋巴细胞(蓝色)、单核细胞(玫瑰红)、粒细胞(墨绿色)、CD45弱表达细胞(红色，主要为原始及幼稚细胞)、CD45阴性表达细胞(绿色，主要为有核红细胞、浆细胞、细胞碎片及血小板)。CD流式图中的横坐标及纵坐标分别代表图中所标示的CD，CD后面为标记的荧光素。

以图2-35的CD33与HLA-DR流式图为例，用十字线将散点图分为四个象限，十字线中的横、纵区域划分线分别代表纵坐标、横坐标上CD阳性线。由此可见，左下象限(LL)为双阴性细胞(CD33－/HLA-DR-)，左上象限(UL)为CD33单阳性细胞(CD33 + /HLA-DR-)，右下象限(LR)为HLADR单阳性细胞(CD33－/HLA-DR + )，右上象限(UR)为双阳性细胞(CD33 + /HLA-DR + )。还可计算该图细胞阴性、阳性、单阳性、双阳性率等，该图中CD33和HLA-DR双阳性率为6. 11%，CD33单阳性率为62. 11%，CD33阳性率为68. 22% (62. 11% + 6. 11%)，HLA-DR单阳性率5. 85%，HLA-DR阳性率为11. 96% (5. 85% + 6. 11%)，其他以此类推。

绝大多数CD在细胞胞膜和胞质同时表达(MPO只在胞质内表达)，但以胞质表达(用Cy或c表示)更为精确，所以胞膜、胞质CD阳性的判断标准也不同。胞膜表达以阳性率≥20%为阳性;胞质表达以阳性率≥10%为阳性，如MPO、CyCD79a、CyCD3及CyCD22等。判断B淋巴细胞是否为单克隆，可观察Kappa/Lamda比值，单克隆通常表现为以Kappa或Lamda表达为主，导致Kappa/Lamda比值异常(如＞3或＜0. 5)。

【正常血细胞免疫分型】

不同细胞群其表达CD有所不同，详见表2-50。CD34、HLA-DR为早期细胞的抗原，无系列特异性。一般而言干细胞/祖细胞为: CD34 +、HLA-DR +、CD38－，原始细胞为: CD34 +、HLA-DR +、CD38 +，而幼稚细胞(如早幼粒细胞)为CD34－、HLA-DR-、CD38 +。下面介绍髓细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞分化及成熟过程中的CD变化特点。

1.髓细胞分化及成熟

CD33是髓系分化中最早出现的抗原，CD34 +、CD33 +的细胞可以形成红细胞爆式形成单位(CFU-B)和粒细胞-单核细胞集落形成单位(CUF GM)。未成熟髓细胞CD13 +，随后出现CD15和CD11b，只在分化终末期才表达CD16和CD10。成熟粒细胞CD15强阳性，CD33弱阳性，但其表达呈高度异质性(即CV值大)，CD13和CD11b中等度表达;相反，成熟单核细胞CD33强阳性(CV值小)，而CD15弱阳性，并表达CD4。在细胞定向分化到红系时，细胞表面出现CD71伴有CD34和CD33的丢失，以及CD45表达下降;随着进一步分化，CD71表达也下降，但血型糖蛋白(glycophorin)表达上调，在分化终末期CD45消失。粒细胞、单核细胞及红细胞抗原分化分别见图2-37～图2-39。

2. B淋巴细胞分化及成熟

B淋巴细胞主要在骨髓中发育，经过了造血干细胞→淋系干细胞→祖B细胞(即前前B，Pro-B)→前B细胞(Pre-B)→过渡性B细胞→成熟B细胞。定向到B细胞的分化过程中是以出现CD19和CD10为标志。CD19的表达具有B细胞特异性，而CD10不具有B细胞特异性(也可在T细胞分化的早期表达)，随着细胞表面IgM出现CD34和CD10就不再表达。

B淋巴细胞占外周血中总淋巴细胞20%左右，其典型的表型是CD19 +、CD20 +、CD21 +和CD22 +，B细胞活化时可再次出现CD10 +。骨髓中淋巴细胞主要为B细胞。B淋巴细胞抗原分化见图2-40。

3. T淋巴细胞分化及成熟

骨髓中的祖T细胞(即前前T细胞，Pro-T)表达CD34、CD7和CD2，当由骨髓迁移到胸腺后发育为成熟T细胞。从T细胞在胸腺发育来看，起初位于胸腺被膜下，然后向皮质、髓质移动，在髓质成熟后进入外周血。根据T细胞在胸腺发育的移动分别称为被膜下T细胞(主要为前T细胞，Pro-T)、皮质T细胞、髓质T细胞;根据T细胞在胸腺中发育过程中CD4、CD8的表达情况分为三个阶段细胞:双阴性细胞(CD4－、CD8－)、双阳性细胞(CD4 +、CD8 +)、单阳性细胞(CD4 +CD8－/CD4－CD8 +)。

T淋巴细胞占外周血中总淋巴细胞约60%～80%，典型表型为: CD2 +、CD3 +、CD7 +及表达CD4或CD8中的一个，也有少数是CD4－/CD8－细胞，但这些细胞已经表达TCR并非未成熟细胞。如T细胞出现活化，有CD38、HLA-DR表达。T淋巴细胞抗原分化见图2-41。

随着识别血细胞表面标志的单克隆抗体的不断出现，以及单克隆抗体结合某些荧光素技术的成熟和完善，促使了流式细胞仪技术广泛应用到正常血细胞生成的研究中。

【临床应用】

在流式细胞仪上可开展白血病及淋巴瘤免疫分型、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、HLA-B27、淋巴细胞亚群、血小板活化、细胞因子、细胞内钙浓度、线粒体膜电位、细胞凋亡及细胞周期DNA含量等分析项目。下面主要介绍在急性白血病中的临床应用，其他血液病中的应用详见疾病的各章节。

恶性血液病通常不存在着特异性标志，只有在两个正常基因相互融合(如BCR-ABL)导致编码新的蛋白出现时，才有特殊的标志物。尽管如此，通常根据一种标志物出现的数量明显高于正常细胞或根据出现一些异常抗原，仍能进行精确的免疫分型和诊断。

所谓的异常抗原(aberrant antigen)指的是:①细胞表达一种标志性抗原，该群细胞在正常情况下不表达这种抗原;②抗原表达不同步性，即细胞表达某种标志性抗原只在特定的分化期才有，而肿瘤细胞往往会在不正确的分化期内表达该抗原。诊断如果仅凭某一种所谓的特异性标志性抗原表达，会容易导致误诊。

对于某些较罕见的细胞标志物，细胞表达百分比显著增加及复合类型(即多种标志物混合出现)，此时应要考虑恶性肿瘤可能。例如，CD34与CD7、CD4和CD56等同时表达，高度提示为骨髓增殖性肿瘤。这些罕见标志物类型不仅具有明确诊断作用，而且治疗后还可以进行微小残留病的监测，例如一些急性髓细胞白血病中，根据CD34+和CD56+的共表达，很容易在104的细胞中检测出一个有这种表型的细胞。

目前骨髓细胞形态学检查仍是白血病诊断及分型的金标准，但白血病免疫分型诊断也成为不可缺少的工具。尤其在以下情况下，免疫分型具有很重要的意义:①形态学检查不能明确细胞株系来源时，免疫分型可以决定其细胞株分化(髓系、T淋巴系、B淋巴系) ;②诊断急性巨核细胞白血病、急性混合表型白血病、急性髓细胞白血病微小分化型及急性未分化型白血病(acute undifferentiated leukemia，AUL)等;③根据免疫球蛋白轻链表达情况，可以判断单克隆性B淋巴细胞增殖性疾病。

典型的AUL表达HLA-DR、CD34但不表达任何株系特异性抗原;急性髓细胞白血病、急性淋巴细胞白血病各亚型的流式细胞仪技术分析特点详见表2-51、表2-52;流式细胞仪技术在诊断淋巴瘤中也有重要作用，各亚型淋巴瘤的免疫表型特征基本同组织免疫组化表型，详见第八章第一节表8-5～表8-8;其他血液病也详见各章节的检验诊断。

【应用评价】

1.分析速度

以每秒获取细胞的数量来标示，目前可达1-数万/s。但在分析过程中并不是越快越好，与分析样本相适应的速度可以保证获取信号的准确性，避免速度过快导致的细胞信号重叠或漂移。

2.精密度

是通过检测标准颗粒的散射光和荧光分布范围来描述的，用变异系数(CV)表示。当使用荧光微球或生物活性细胞评价仪器精密度或进行质控时，CV＜5%可满足大多数实验项目的要求，而目前大多数流式细胞仪的CV%约为1%～2%，能满足这一要求。

3.准确度

有较多的因素影响流式细胞仪的准确度，其中最重要的为非线性问题。此外，流式细胞仪计数已知浓度的标准微球也有偏差，但目前尚无具体标准，实验室可通过国际或国内的一些室间质评来控制仪器的准确度。

4.灵敏度

包括前散射光及荧光灵敏度等。前散射光灵敏度主要是指FS检测到最小微粒的直径，可检测到的直径越小，灵敏度越高，目前仪器可达0. 1～0. 5μm。荧光灵敏度主要是评价仪器检测到的最低荧光信号的能力，目前常用可溶性荧光染料等价分子数(MESF)法来表达，如MESF值为1000 的FITC微球其荧光强度等同于1000个FITC分子，目前较先进的流式细胞仪的荧光灵敏度可到＜100个荧光素分子(如FITC或PE分子)。

流式细胞仪的应用技术在临床上已经得到很大的扩展，在免疫学方面已经是不可缺少的一项技术。随着对流式细胞仪技术的深入研究，目前已经将从细胞水平延伸到分子水平，打破了传统的“细胞术”的局限，可以将流式细胞仪技术应用到血浆蛋白的测定、基因表达等，但目前这些方面的应用还多数限于基础研究方面，在临床上的应用还需要建立稳定和有效的方法学，相信将来的流式细胞仪技术能在临床上发挥更大的作用。

(沈志坚)