第六节　化学发光检测的联用技术

一、概述

化学发光分析法以其仪器简单、操作方便、分析快速、灵敏度高、线性范围宽等显著的优点备受人们青睐，是一种有效的微量和痕量分析技术。然而，化学发光反应固有的选择性差的缺点使得这种分析方法受到了极大的限制。如何将高灵敏度的化学发光法和高选择性的分离技术结合，是分析化学发展的一个前沿方向。

高效液相色谱（HPLC）是近四十年发展的一种分离技术。它具有分离效率高、分析速度快、自动化强等特点，是石油、化工、环保、医药、生化等部门科研和生产中分离检测的一个重要工具。毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）是以高压直流电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间电泳淌度或分配行为的差异而实现分离的一种新型液相分离技术。

化学发光检测手段与具有高效分离能力的高效液相色谱法（HPLC）、毛细管电泳（CE）、微流控芯片等分离技术相结合，兼具分离效率高和灵敏度高的优点，可直接用于复杂样品中微量组分的分离和测定，成为理想的分离分析方法，在生命科学、医学、药学、环境科学等领域中得到了广泛的应用。

二、化学发光检测的联用技术分类

1.高效液相色谱-化学发光联用技术（HPLC-CL）

高效液相色谱化学发光联用是通过液相色谱分离系统分离混合物中的各组分，再利用化学发光检测系统对各组分进行测定的技术。HPLC-CL检测装置一般由图9-15所示的几个部分组成，往往包括输液泵、色谱柱、混合器和化学发光检测器。待测组分经色谱柱分离后与发光试剂混合发生化学发光反应，流通池内的发光信号由光电倍增管或者其他光电转换器件转换并放大，最后由记录仪或数据采集装置记录。作为色谱柱后检测的常用化学发光体系有鲁米诺、高锰酸钾、四价铈等。

要获得好的分离和灵敏的检测，往往需要综合考虑各方面的因素：①流动相的选择应与化学发光检测系统相兼容，此外，还要考虑发光试剂在其中的溶解度，以避免发生沉淀。②pH对化学发光反应的发光强度影响很大，因此选择合适的pH十分重要。③应选择适宜的流速，以保证分离完全并能检测到强的发光信号。④所用试剂应纯化，以减小化学发光的背景。⑤化学发光检测器的设计应死体积要小、仪器简单、便于操作。

2.毛细管电泳-化学发光联用技术（CE-CL）

毛细管电泳技术（CE）是以高压直流电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间电泳淌度或分配行为的差异而实现分离的一种新型液相分离技术。它结合了经典电泳和现代微柱分离技术，具有分离效率高、分析速度快、样品和试剂消耗少的优点，使分析科学从微升水平进入纳升水平，是继高效液相色谱之后分析科学领域的又一次开拓性贡献。自从20世纪80年代该方法创立以来，已广泛应用于无机离子、有机分子和生物分子的分离分析。毛细管电泳在生物大分子的分离分析方面与HPLC相比尤其具有优势。其中将电致化学发光和毛细管电泳结合起来，可以兼备电化学发光的高灵敏度和毛细管电泳的高分离效率的特点，直接用于样品中微量组分的分离和测定，是一种极具应用潜力的分离分析技术。

毛细管电泳-化学发光联用技术中，毛细管电泳电致化学发光利用技术是最为常见的一种，该技术是结合毛细管电泳的高效分离性和电致化学发光的高灵敏性的一种现代分析技术。其中最常用的电致化学发光检测体系是钌（Ⅱ）联吡啶化学发光体系。钌（Ⅱ）联吡啶类化合物具有水溶性好、稳定性强、发光效率高、电化学可逆、可重复激发、检测灵敏度高、线性范围宽等优点，得到了研究者的广泛关注。

3.微流控芯片-化学发光联用

微流控实验室通常被简称为微流控芯片（microchip）或芯片实验室（lab on a chip），它把化学和生物等领域中所涉及的样品制备、反应、分离检测、细胞培养、分选和裂解等基本操作单元集成到一块很小的芯片上，由微通道形成网络，以可控流体贯穿整个系统，以实现常规化学或生物实验室的各种功能。一般微通道的尺寸为几十到几百微米，承载10-18～10-9L的微流体。微流控芯片电泳与化学发光、电化学发光分析方法联用显著地提高了化学发光分析方法的选择性和特异性，减少了假阳性结果，因此受到研究人员的广泛关注。在毛细管电泳-电化学发光技术发展的基础上，Ru（bpy）₃2+电化学发光技术近几年才开始逐渐应用于微流控芯片技术。而电化学发光方法在药物分析、免疫分析和DNA探针分析中的应用，说明电化学发光方法是一种非常有前景的检测技术。而这两种分析技术结合将会在医药、化学、环境及单细胞分析等诸多领域拥有广阔的应用前景。

三、化学发光检测的联用技术的应用

1.液相色谱-化学发光联用技术的应用

在众多体系中应用最多的是鲁米诺及其衍生物的化学发光体系、过氧草酸酯化学发光体系，除此之外，Ce（Ⅳ）、高锰酸钾、钌（Ⅱ）联吡啶、铁氰化钾、光泽精和吖啶酯等体系也被广泛应用于高效液相色谱-化学发光联用技术中。

高锰酸钾试剂是一种强氧化剂，在酸性介质中其氧化性更强，可以直接或间接和某些分析物发生化学反应，释放出大量能量将中间产物激发至激发态，向基态跃迁时以光的形式释放能量，辐射光的强度与分析物的浓度呈线性关系，从而达到检测分析物的目的。

铈属于镧系金属，四价态具有强氧化性，可以直接氧化一些具有还原性的物质如亚硫酸盐、含巯基物质等，在反应中可产生弱的化学发光，可以利用发光的强度与分析物的浓度形成的线性关系直接来测定这些物质。有些分析物对四价化学发光体系具有增敏作用，由此可以通过所增强的化学发光强度与分析物浓度的线性关系来达到检测的目的。

光泽精在碱性介质中可被过氧化氢等氧化剂氧化产生化学发光。在有Cr（Ⅲ）、Fe（Ⅱ）、Ni（Ⅱ）、Co（Ⅱ）等金属离子催化剂存在时，对此发光体系有增敏效用，由此可定量测定某些催化剂或催化剂标记物的组分。

表9-1列举了部分液相色谱-化学发光联用技术在各领域应用的事例。

2.毛细管电泳-化学发光联用技术的应用

利用某些金属离子能增强或抑制化学发光的现象，毛细管电泳化学发光法最初应用于金属离子的分离分析。其中应用最为广泛的是鲁米诺-过氧化氢发光体系。基于V（Ⅳ）、Nb（Ⅳ）、Ta（Ⅴ）、Cr（Ⅲ）、Cr（Ⅵ）、Fe（Ⅱ）、Fe（Ⅲ）、Ni（Ⅱ）、Co（Ⅱ）、Cu（Ⅱ）等对鲁米诺化学发光体系的显著增强作用，实现了毛细管电泳-化学发光法对这些金属进行了分离检测。随着毛细管电泳分离技术在生命科学领域的迅速发展，毛细管电泳-化学发光法在氨基酸和多肽的检测方面体现出了一定优势。相比传统的色谱方法，其样品前处理更加简便，多数无须衍生，且分离效率高于高效液相色谱。随着新的化学发光体系不断被发现，继鲁米诺-过氧化氢体系之后，鲁米诺-铁氰化钾等发光体系越来越多地被用于各种药物的分析，化学发光检测用于药物分析成为分析科学领域的一个热点领域。近年来毛细管电泳-化学发光联用用于药物测定的文献报道如表9-2所示。

（程祥磊）