第五节　电致化学发光分析

电致化学发光（electrochemiluminescence or electrogeneratedchemiluminescence，ECL），又称电化学发光，是指通过电化学手段，在电极表面产生一些电生的物质，然后这些电生物质之间或电生物质与待测体系中的某些组分之间通过电子传递形成激发态，由激发态返回到基态而产生的一种发光现象。电致化学发光分析法是电化学技术与化学发光分析有机的结合，通过测量电致化学发光的强度与被测物质间的线性关系进行定量分析的一种方法。

电致化学发光的发现可以追溯到1927年，Dufford等发现Grignard化合物在溶剂醚中电解可产生发光。1929年Harvey在电解碱性鲁米诺水溶液时，发现在阴极及阳极上都有发光现象，揭开了电致化学发光研究的序幕。由于电致化学发光反应建立在电化学反应基础之上，且本身也是一个发生在电极表面附近空间，受电极表面环境等因素影响的化学发光过程，因此它具有许多自身独有的性质和特点。该技术集成了化学发光的高灵敏度和电化学电位可控性等优点，克服了化学发光分析中存在的一些缺点，如一些化学发光试剂特定条件下不稳定，难以实现时间和空间上的控制，化学发光试剂难以重复使用等。进入21世纪，电致化学发光的应用范围更广，研究者对反应机理的认识更深入，其已成为分析化学工作者的热点研究领域之一。

一、基本原理

电致化学发光反应实际经历两个过程：电化学反应和化学发光反应。电化学反应过程提供发生化学发光反应的中间体，而这些中间体之间或中间体与体系中其他组分之间发生化学反应产生化学发光。电化学反应不同，其发光机理不尽相同。下面以钌（Ⅱ）联吡啶电致化学发光体系及其机理为例进行介绍。

1972年，Tokel和Bard首次发现了的电致化学发光现象，开始对类金属配合物无的电致化学进行了一系列的详细研究，奠定了电致化学发光的应用基础。钌（Ⅱ）联吡啶的化学结构如图9-14所示：

由于具有水溶性好、化学性能稳定、氧化还原可逆、发光效率高、应用的pH范围较宽以及可电化学再生和激发态寿命长等特点而广泛应用于电致化学发光。其反应机理一般认为主要有以下四种。

1.氧化还原-循环电化学发光

也称为双电位电化学发光，是指当对电极施加正负双阶跃脉冲时，在+1.3～-1.3V（vs.Ag/AgCl）电位范围内，分别发生氧化和还原反应，生成和，两者发生湮灭反应，生成激发态的返回基态时，产生化学发光。

2.氧化-还原型电化学发光

当体系中存在强还原性共反应物如三丙胺、草酸等时，对电极施加一个合适的氧化电位，可使氧化为，同时三丙胺、草酸等也在电极上被氧化，并进一步地生成还原型中间产物。该产物与可发生氧化还原反应，产生激发态的［，从而产生发光。

3.还原-氧化型电化学发光

当体系中存在强氧化性物质时，对电极施加一个合适的还原电位，可将还原为，同时另一共反应物也在电极上被还原，生成强氧化性的中间体与发生氧化还原反应，产生激发态的，返回基态时引起发光。

4.基于溶解氧还原的阴极电化学发光

以上三种发光过程都是在很正或很负的电位下进行的。另一种基于溶解氧还原的阴极电化学发光，该过程的激发电位仅为-0.4V，故可以在更温和的条件下产生电化学发光，而且，所有能增强氧化还原型电致化学发光的物质都能增强该类型的电化学发光。

二、电致化学发光技术

（一）电化学发光传感器

电化学发光传感器（ECLsensor）是指通过化学修饰的方法将直接或间接参与化学发光反应的试剂固定在电极表面而形成的一类试验装置。与化学发光传感器相比，电化学发光传感器克服了前者需要源源不断补充发光试剂的不足，减少了昂贵试剂的使用，并简化了试验装置。、鲁米诺或其衍生物固定化制成电化学发光传感器是近年来电化学发光领域研究的重要方向。

（1）电化学发光传感器：

在电化学发光中，电化学发光传感器从用途上主要分三种：一是基于固定化的电化学发光酶传感器；二是电化学发光免疫传感器与DNA探针；三是利用电化学发光制备的发光器件。若是按照及其衍生物的固定化方法，又可以分为四种，即利用Langmuir-Blodgett膜、分子自组装膜、离子交换聚合物薄膜或溶胶-凝胶（sol-gel）等技术进行固定化。钌（Ⅱ）联吡啶在反应前后的化学形态和性质基本不变，是一个循环反应过程。但，目前固定联吡啶钌的方法普遍存在稳定性差、使用寿命短、修饰物易泄漏等问题。研究和开发新的固定化材料将是今后发展的重点。

（2）鲁米诺电化学发光传感器：

鲁米诺是酰肼类化合物中最具代表性的电化学发光物质。与联吡啶钌不同，鲁米诺的电化学发光是不可逆的。所以涉及鲁米诺电化学发光反应的传感器固定化的试剂不是鲁米诺分子，而是间接参与发光反应的底物氧化酶。这类装置也称为电化学发光生物传感器。许多生物活性物质如葡萄糖、胆碱和乳酸等，在底物氧化酶催化作用下产生过氧化氢，过氧化氢对鲁米诺电化学发光体系有增敏作用，即可实现对这些生物活性物质的电化学发光检测。鲁米诺的电化学发光在碱性介质中的发光效率较高，但碱性介质对酶活性有不良影响，如何解决两者的pH不匹配问题是鲁米诺电化学发光生物传感器研究的重点。

（二）电化学发光核酸杂交分析

核酸分子杂交技术是定性或定量检测特异性RNA和DNA序列片段的有力工具。作为最基本、最常用的一种分子生物学方法技术，已经普遍应用于生命科学和医学基础研究的各个领域。随着化学发光核酸探针引入杂交分子的检测，其过程避免了放射性同位素的污染和危害。该方法结合了电化学发光检测技术与核酸分析的优点，成为近年来的一个研究热点，在基因分析、基因定位和疾病早期诊断方面显示了发展潜力。但该方法存在的不足是化学发光结束后样品的发光无法再现。

电化学发光核酸杂交分析的步骤包括以下几步：①将ssDNA固定到电极表面，形成DNA探针电极；②将DNA探针电极放入含有互补靶标ssDNA的被测液中，在电极表面形成dsDNA；③测量电化学发光信号。电化学发光核酸杂交分析的标记物有衍生物、鲁米诺及其衍生物等。

根据电化学发光指示剂与核酸作用方式的不同，可将电化学发光核酸杂交分析分为两种类型：标记剂型和嵌入剂型。标记剂型是指发光活性物质通过化学键合的作用直接或间接地连接在ssDNA链的末端，得到电化学发光活性物质标记的ssDNA探针，该探针与固定在电极上的目标ssDNA通过碱基配对原理进行杂交，实现电化学发光检测。嵌入剂型电化学发光核酸杂交分析，是指将杂交反应后的电极浸入含嵌入剂的溶液中反应一段时间，或将嵌入剂直接加到杂交反应的溶液中，让杂交反应和嵌入作用同时进行，然后再进行电化学发光检测，电化学发光信号的变化值可以反映电极表面形成dsDNA的多少。

（三）溶出电化学发光分析

溶出电化学发光分析法是一种新型的化学发光分析法。该法先将金属离子从大体积的试液中富集在微小的电极上，同时通过控制各种条件进行电位溶出或化学溶出，将被测离子选择性地富集在电极表面而溶出，并在电极表面的扩散层中发生发光剂反应，产生发光信号。这种方法克服了化学发光法选择性较差的不足，结合了溶出伏安法的高选择性和化学发光法的高灵敏度的优点。

（四）电生试剂化学发光分析

化学发光反应多为氧化还原反应，常见的氧化剂包括H₂O₂、K₃Fe（CN）₆、KMnO₄、Ce（Ⅳ）以及ClO-、BrO-、Co3+、Mn3+、Cu3+、Ag2+等。其中一些氧化剂不是很稳定，如ClO-、BrO-、Co3+、Mn3+、Cu3+、Ag2+等，在溶液中很快就被还原，影响使用。通过利用电化学在线产生不稳定试剂，可以解决试剂不稳定的难题。电生试剂化学发光分析法，即利用恒电流电解在线电生某些高活性的参加化学发光反应所需的试剂，通过直接氧化还原反应，或通过能量转移或增敏反应而建立的一种电化学发光分析方法。目前已用于一些神经递质、抗生素和药物有效成分的检测。

（五）电位分辨的电化学发光

在不同的电位下，鲁米诺、光泽精等传统的发光物质具有多个电化学发光反应通道，同时发现脉冲激发的电化学发光不能分辨这些通道，这种循环伏安驱动电化学发光，被称为电位分辨的电化学发光。

电位分辨的电化学发光图类似于循环伏安图，但比后者更灵敏。一些氧化还原过程在循环伏安图上无峰或有较弱峰，但在电位分辨的电化学发光图上呈现清晰的峰。通过对电位分辨的电化学发光行为和规律进行观察，发现了鲁米诺、光泽精、体系的电化学发光多通道现象和对电极电位、电极材料和电极表面状态的依赖性，提出了各通道的反应机理。电位分辨的电化学发光为电化学发光的研究提供了一条新的思路，对电化学发光机理研究和探索新的电化学发光反应具有重要的意义。

三、电致化学发光检测技术应用

1.无机物的测定

利用EDTA螯合物与产生电化学发光，可以建立测定金属离子的电化学发光分析法。通过这种方法研究亲氮金属离子，检测限可达nmol/L级别。如用电化学溶出伏安法测定了水样中铜离子的浓度，检测限达0.02μg/L，该方法无论是灵敏度还是选择性都优于普通的阳极方波溶出伏安法或是化学发光法。利用还原-氧化型电化学发光可以在碳糊电极上检测SO2-O ₂₈

2.有机物的测定

电化学发光体系广泛应用于胺类、氨基酸和多肽、蛋白质、核酸、药物的检测。利用地塞米松磷酸钠能够使Mn3+-NaSO₃体系的化学发光大大增强的原理，张成孝等建立了在线电生Mn3+流动注射电化学发光法测定地塞米松磷酸钠的新方法。利用在线电生不稳定试剂化学发光法，已经建立了测定多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素、儿茶酚胺、潘生丁、安乃近、异烟肼、喹啉、抗坏血酸、维生素B₁等的方法。