第十八章　细胞凋亡显像

细胞凋亡（apoptosis）存在于多种病理过程中，包括神经系统变性疾病、缺血性损伤、自身免疫病和多种肿瘤等。凋亡检测的可视化对疾病诊断、新的治疗方法开发与疗效评价具有重要的意义。近年来，随着人们对凋亡生物学过程的深入了解，针对体内凋亡靶点的分子探针包括荧光标记、生物发光、放射性核素标记和磁共振凋亡显像的探针逐步得到开发应用。

第一节　概 述

细胞凋亡又称程序性细胞死亡（programmed cell death），是多细胞生物在胚胎发育、正常组织稳态的维持与各种生理病理情况下机体清除多余细胞的重要方式。凋亡异常，如自身免疫性疾病与神经退行性疾病（细胞凋亡发生过多）或肿瘤组织生长（细胞凋亡发生过少），与凋亡的发生紧密相关。有效的治疗如放疗、化疗、联合放化疗之后，均能引起肿瘤细胞的凋亡。因此，监测凋亡的过程具有重要意义。

细胞凋亡途径主要归纳为以下三种：一是线粒体凋亡途径，又称内源性凋亡途径，由Bcl-2超家族成员介导。二是死亡受体途径，又称外源性凋亡途径，由特异的死亡受体与相应的配体结合而介导，如肿瘤坏死因子（TNF），TRAIL和FasL（与Fas受体结合的配体）。三是内质网应激反应介导的细胞凋亡。半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶（Caspases）家族在程序性细胞死亡过程中发挥着非常重要的作用，通常情况下Caspase以酶原的形式存在于细胞质内。各种凋亡途径最终都汇聚于执行分子Caspase-3的激活，Caspase-3的激活最终会导致poly-ADP-ribose polymerase（PARP）的激活，并伴随凋亡细胞形态学改变。凋亡的一个早期变化是磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）外翻，在活细胞中PS分布于细胞膜脂质双层的内侧，一旦凋亡发生，PS便外翻至细胞脂质双层的外侧。随着PS外翻，细胞质皱缩，随后细胞皱缩，质膜出泡，细胞分裂为凋亡小体。由于在形态学与分子生物学上非常相似，凋亡常与其他类型细胞死亡混淆，如自噬与程序性坏死。因此，寻找区分凋亡与其他类型细胞死亡过程的方法对于治疗具有重要作用。

目前已有多种方法用于凋亡检测，主要包括光学显微镜、TUNEL分析、流式细胞仪等，这些传统的体外检测凋亡的方法是体内显像方法的重要补充，但活体内凋亡显像有助于无损观察、了解凋亡发生的体内过程。因此，本文主要从凋亡的生理过程入手，讨论显微与宏观的凋亡检测，从而设计出合理的靶向生物化学变化的凋亡探针，为凋亡显像的临床应用提供相关的理论及指导。

第二节　凋亡的微观检测

近年来，关于凋亡的机制及生理过程的研究越来越多，从而使基于荧光的分析方法得到了发展，如通过光学显微镜、流式细胞仪观察标记的凋亡标志物。以下部分将从化学水平介绍用于细胞水平凋亡分析的分子探针。

一、荧光标记的annexin探针

annexin Ⅴ是一种大小为35～36kD的Ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白，与PS（磷脂酰丝氨酸）具有高亲和力（Kd = 0.1nmol/L）。在活细胞中，PS分布于细胞膜脂质双层的内侧，不与annexin Ⅴ结合。一旦发生凋亡，PS变外翻至细胞脂质双层的外侧，在Ca²⁺存在的情况下与annexin Ⅴ结合。在与膜上的PS结合后，annexin Ⅴ的结构由单体转变为三聚体，以二维点阵的方式聚集，并以三聚体-三聚体相互作用的方式覆盖于膜外侧PS上。annexin Ⅴ标记荧光是一种快速、可靠的研究PS外翻的方法，也是发现早期凋亡的指示剂。这种试剂须在活细胞或组织洗涤和固定前15分钟给药。然而，PS同样会出现于坏死细胞的表面，因此会引起假阳性结果。为了克服以上缺点，常将核酸染料PI与annexin Ⅴ联合并通过光学显微镜或流式细胞仪区分活细胞、早期凋亡、晚期凋亡和细胞坏死。

在活细胞成像实验中，荧光标记的annexin Ⅴ探针与凋亡细胞结合需要经历不同阶段，进行分析前首先要去除未结合的蛋白从而降低本底荧光。因此对于活细胞成像来说，annexin Ⅴ探针不是最佳选择。pSIVA（细胞活性与细胞凋亡的敏感指示剂）是一种基于annexin Ⅻ的极性、敏感探针，用于凋亡与其他细胞死亡形式的时空分析。重组pSIVA蛋白可与一种灵敏的极性染料IANBD结合，只有当pSIVA与细胞膜结合时，才会发出荧光。与不可逆的annexin Ⅴ结合相比，这种膜结合依赖的荧光以及可逆结合是技术上的一大进步，为凋亡通路与细胞存活研究提供了更多信息。

二、基于显色Caspase底物的探针

Caspase又称半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶，是细胞内调控程序性细胞死亡的蛋白酶家族，它的激活在细胞凋亡中发挥重要作用。大多数凋亡信号通路使细胞内Caspase激活，并产生一系列复杂的生物化学变化从而传导死亡信号。由于Caspase在凋亡过程的关键作用，人们构建了针对Caspases家族不同成员的特异性抑制剂与底物，用于监测早期的细胞凋亡。荧光标记的DEVD（天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸）是最常用的检测Caspase-3/-7活性的多肽。当Caspase-3/-7被Caspase-3剪切后，可通过光学显微镜检测释放的荧光信号。Caspase-3底物DEVD-NucView 488，是一种带负电荷DEVD多肽，通过结合具有DNA结合特性的染料而抑制染料与DNA结合，从而使DNA不显示荧光。这种底物可以快速穿越细胞膜进入细胞质，经Caspase-3剪切而成为高亲和力DNA染料NucView 488，被释放的DNA染料迁移至细胞核并使之染色。因此，这种双功能底物可用于检测凋亡细胞的Caspase-3，同时可以将细胞核染色，而细胞核在凋亡过程中也会发生形态学改变。研究者们已构建了Caspase-3底物DEVD-NucView 488联合其他荧光探针，用于不同事件时间与空间关系的研究。

三、基于亲脂性阳离子染料的探针

线粒体是启动凋亡的一种信号来源，在细胞凋亡中发挥重要作用，线粒体功能障碍会引起凋亡发生。线粒体功能障碍最早期的特点是线粒体膜电位改变，而后诱导凋亡发生。因此，越来越多的研究者开始关注完整细胞的线粒体膜电位。Cossarizza 等报道了使用 5，5′，6，6′-tetrachloro-l，l′，3，3′-tetraethylbenzimidazol-car bocyanine iodide（JC-1）监测完整活细胞线粒体膜电位的改变，JC-1是一种以单体形式存在的亲脂性阳离子染料，经490nm波长的光激发后可以释放出527nm波长的光。当处于高线粒体膜电位时，JC-1会形成J-聚集，释放590nm波长的光并出现红移现象。因此，健康细胞线粒体呈现鲜红色荧光，而由于线粒体膜电位的破坏，JC-1无法聚集于线粒体，只能以单体形式留在细胞质中，表现为绿色荧光。从而可以轻松区分绿色荧光的凋亡细胞与呈现红色荧光的健康细胞。此外，其他荧光染料如TMRE或TMRM，Rhodamine123同样可以用于监测线粒体膜电位的变化。

四、TUNEL检测

DNA在核小体间断裂成碎片后称为DNA条带，是判断细胞凋亡的重要标志，标记DNA片段是一种检测细胞凋亡的重要方法。20世纪90年代初由Garvrieli等首先报道的TdT mediated dUTP-biotin nick end labeling（TUNEL）检测已成为使用最广泛的检测凋亡DNA片段的方法，此方法基于DNA断裂后出现的缺口可被末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）识别。新的方法使用由荧光素或一些小分子物质如生物素（biotin）或溴盐（bromine）标记的dUTPs，荧光素标记的核苷酸（如fluorescein-dUTP）可被直接检测，由链霉亲和素或抗体标记的核苷酸（如biotin-dUTP或Br-dUTP）则可被间接检测。另一种方法是使用5-ethynyl-2′-deoxyuridine（EdU），一种由炔修饰的dUTP，它较其他物质标记的核苷酸更易被TdT结合。与其他方法相比，这种新的方法不仅更快，特异性更高，而且无需将DNA变性。

第三节　凋 亡 显 像

凋亡显像用于监测体内细胞凋亡具有重要的临床意义。现介绍几种已明确的并已用于凋亡显像的分子探针，如靶向PS、细胞表面暴露的组蛋白、膜电位以及细胞内靶点如Caspases、线粒体膜电位等。

一、放射性核素凋亡显像

随着SPECT与PET的发展，以及针对分子靶点的放射性核素示踪剂的研制，使核医学进入分子影像学的新时代。核医学显像示踪剂发展的关键一步是放射性核素标记。下面讨论几种便捷的、有效的标记模式和针对体内凋亡靶点的放射性标记探针。

（一）放射性核素标记模式

将放射性核素与探针分子结合的方式很多，由于探针分子对靶点的特异性，因此，位点专一的放射化学技术对制备具有生物学活性的探针非常重要。

（二）放射性标记的annexin Ⅴ蛋白探针

annexin Ⅴ与PS结合是细胞凋亡显像中使用最广泛、最成功的一种。^99mTc标记annexin Ⅴ是目前为止用于凋亡检测研究最多、使用最广泛的放射性配体。^99mTc-BTAP-annexin Ⅴ是第一个用于活体研究的探针，但其制作过程烦琐、耗时、放射性化学产率低。Blankenberg等1998年首次描述了^99mTc-HYNIC-annexin Ⅴ的制备方法，作为annexin Ⅴ放射性标记方法的替代。制备^99mTc-HYNIC-annexin Ⅴ需要合成HYNIC配体，这是一种烟酸类似物，具有双功能螯合能力，一方面可与NH₂末端氨基酸和蛋白赖氨酸残基相连，另一方面可以螯合^99mTc，即HYNIC与annexin Ⅴ相连，并在二价锡离子存在的情况下使用tricine作为共配体与^99mTc进行标记。HYNIC-annexin Ⅴ是一种稳定的复合物，可与^99mTc快速有效地进行标记。与^99mTc-BTAP-annexin Ⅴ相比，^99mTc-HYNICannexin Ⅴ的制备过程更快、更简单，所需起始放射性活度（1.11～1.48GBq）较低。^99mTc-HYNICannexin Ⅴ是目前为止唯一一个用于非小细胞肺癌患者Ⅱ/Ⅲ期临床凋亡显像的放射性药物，然而由于靶/非靶比值不高而停滞使用了。研究者使用annexin Ⅴ及它的突变体与 ^99mTc、⁶⁷Ga、¹¹¹In、¹⁸F等标记进行体内显像的研究也正在进行中。

突触结合蛋白Ⅰ的C2A结构域是一种具有钙依赖性PS结合能力的神经系统蛋白，用于PET显像的¹⁸F-C2A-GST是通过［¹⁸F］SFB标记C2AGST进行体内凋亡显像。

此外，糖蛋白乳凝集素（又称MFG-E8，PAS-6/7）在钙离子存在的条件下也可与PS结合。^99mTc-HYNIC-乳凝集素具有乳凝集素一样的磷酸结合特性，生物分布研究显示，它可快速被血液清除并在肝脏聚集。与^99mTc-annexin Ⅴ相反，^99mTc-乳凝集素在肾脏有较低的摄取，因此可以用于肾脏细胞凋亡显像的研究。

（三）放射性核素标记的多肽凋亡显像探针

PSBP-6是一种能够特异性靶向PS膜的14个氨基酸的小分子多肽，Song等发现^99mTc-SAACPSBP-6（SAAC：single amino acid chelae；PSBP：phosphatidylserine-binding peptide）γ显像可以早期监测化疗药物诱导的肿瘤细胞凋亡，有望成为除¹⁸F-FDG之外的肿瘤早期疗效监测的方式（图18-1，图18-2）。

细胞膜上出现磷脂酰乙醇胺（PE）也是凋亡的一种通用指示剂。耐久霉素（duramycin）是由19个氨基酸组成的二硫化交联的肽，它可与PE特异性结合并具有高亲和力。Duramycin由HYNIC共价修饰并由^99mTc标记，强大的结合能力与适宜的药代动力学特性使^99mTc-Duramycin成为一种有效的体内凋亡显像探针。

细胞表面暴露的组蛋白也是凋亡的一种蛋白，Wang等用噬菌体技术发现了一种可以靶向结合凋亡细胞膜表面组蛋白1（H1）的肽apopep-1。¹²⁴I-apopep-1 PET显像可在体检测肿瘤细胞凋亡，用于对肿瘤化疗早期反应的监测。

（四）放射性标记的小分子探针

与蛋白、多肽探针相比，小分子具有合适的药代动力学特性，快速扩散率、血池清除率，因此更具临床应用潜力。Smith等使用Zn-DPA配合物作为靶向PS的另一种选择。另有研究者使用¹⁸F标记Zn-cyclen体内PET显像用于肿瘤治疗后的凋亡监测。然而，由于Zn-DPA和Zn-cyclen探针在肝脏与其他器官聚集较高，因此尚需进一步进行优化。

ApoSense家族是另一种小分子凋亡探针，包括DCC、NST-732和dansyl-ML-10，它们可与凋亡细胞外翻的PS结合进行凋亡显像。¹⁸F-ML-10凋亡显像剂是第一个进入临床前研究的PET显像剂。临床前研究表明，脑卒中区域脑组织对¹⁸FML-10的摄取与组织学证据一致。对志愿者进行Ⅰ期临床试验表明，¹⁸F-ML-10在体内具有高稳定性，适宜的药代动力学特性。Ⅱa期临床试验阶段，对急性脑卒中患者已获得了神经细胞凋亡的PET影像。

Caspase是半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶，在调控细胞凋亡中起关键作用，Isatin是Caspase的抑制剂。¹⁸F-ICMT-11是Caspase-3特异的小分子PET示踪剂，具有非常高的放射性比活度。¹⁸F-ICMT-11已经在健康志愿者进行了体内生物分布与辐射吸收剂量的研究，结果显示其快速聚集于肝脏与肾脏，随后经肾脏与肝胆管清除。另一个Isatin系列的显像剂是¹⁸F-WC-Ⅱ-89，在PET成像大鼠模型中，¹⁸F-WC-Ⅱ-89在治疗组肝脏与脾脏摄取是对照组将近2倍，体内分布也与Caspase-3的活性良好相关。

另有一些主要用于凋亡显像的小分子探针：¹⁸F-FBnTP靶向作用于凋亡早期阶段跨越线粒体内膜的质子电化学梯度的崩解，HSP90是凋亡的主要抑制剂，GSAO［4-（N-（S-glutathionyl-acetyl）amino）phenyl-arsonous acid］可以快速在细胞质中聚集，并主要与HSP90 C-末端的高保守Cys-Cys域（Cys719和Cys720）通过共价进行交联。使用DTPA和¹¹¹In修饰GSAO可对肿瘤模型细胞凋亡进行在体SPECT/PET成像。

二、光学成像探针

随着活细胞荧光显微镜的出现，大量光学显微模式应运而生。近年来，光学成像仪器与精细的光学探针的研发使对小动物整体，组织与细胞层面的非侵入性、实时显像成为可能。尤其是近红外光（near-infrared，NIR）荧光素与配体的结合大大扩展与改善了光学成像系统的性能。

（一）荧光标记的凋亡探针

近红外光荧光染料Cy5.5标记的annexin Ⅴ，是第一个用于肿瘤细胞凋亡检测的在体凋亡显像探针，治疗后肿瘤模型Cy5.5-annexin Ⅴ荧光信号比对照组明显增高。荧光断层显像技术（FMT）可对深部组织进行定量三维成像，能精确地分辨出深部肿瘤对于化疗的敏感性，克服了NIR低分辨率、缺乏量化的缺点。有研究者将Zn-DPA与NIR荧光素结合，模拟annexin Ⅴ的凋亡信号传递作用，其凋亡检测能力已在动物模型中得到验证。

（二）荧光-淬灭可激活探针

近年，“可激活探针”或“职能探针”已成为靶向光学显像最具吸引力的一种新型探针，它能持续不断的发射信号，属于“永远开启”状态。这种探针的缺点是，无论它们接近组织或细胞还是与组织或细胞相互作用，均会发射信号，因此会形成强大的背景信号。Bullok等制备了一种靶向Caspase的具有膜通透性的探针TcapQ647，能识别Caspase的效应序列DEVD，从而激活染料QSY 21/Alexa Fluor 647。研究表明TcapQ647是一种敏感的、用于检测凋亡的职能探针。研究发现了另一种多肽序列KKKRKV探针，明显提高了信号敏感性并且降低了细胞毒性。

纳米粒子为不同的淬灭剂-荧光团组合如多对一或多对多提供了平台，目前已成功研制出多聚和无机纳米粒子依赖的可激活探针。Lee等报道了一种可激活纳米探针，这种探针可有效地将双淬灭Caspase-3敏感的荧光肽运送至细胞，使Caspase-3依赖的信号放大并进行体内、体外显像。

（三）生物发光成像探针

大多数可激活探针使用荧光作为报告信息，而生物发光成像（BLI）由于它的高信-噪比成为另一种有前途的光学成像模式。大多数重组生物发光探针由“三明治”线性结构组成：Luc-DEVDreceptor。它们的分子非常大，且在凋亡过程中对DEVD片段酶切不足，从而使荧光信号的强度相对较低。Kanno等设计了一种基因编码的环状荧光素酶来检测活细胞与动物蛋白酶活性。这一环状荧光素酶可以定量检测经胞外刺激的活细胞caspase-3活性，并可对小鼠caspase活性进行时间依赖非侵袭性成像。水母与萤火虫荧光素酶的底物分别是腔肠素与D-荧光素，均已被用于检测动物不同的生物学过程。使用两种不同的荧光素酶或可激活荧光素酶用于两种或更多的生物学过程成像，大大地提高了荧光成像的效用。

三、磁共振成像显像剂

由于MRI在时间、空间分辨率方面的优势，能够进行单个细胞、器官，甚至动物模型的生物学过程监测。然而，MRI的敏感性低，对比造影剂的出现克服了这一缺点。Gd螯合剂与IONPs（超顺磁性氧化铁纳米粒子）是应用最广的MRI造影剂。MR凋亡成像造影剂的开发提供了另外一种新型的显像模式。

（一）磁性标记模式

Gd（Ⅲ）螯合剂是临床最常用的MRI造影剂之一。由于Gd（Ⅲ）具有内在毒性如严重的干预钙离子通道、蛋白结合位点，所以不可直接以自由离子的形式注射。Gd（Ⅲ）离子需与螯合剂结合从而最大限度降低毒性。最常使用的螯合配体是DTPA、DOTA以及它们的衍生物。为了使Gd-DTPA、Gd-DOTA与生物相容性大分子结合，研究者研发了DTPA与DOTA的各种双功能螯合剂。双功能配体与小分子Gd螯合剂较易与许多大分子结合，如蛋白质、聚合物、树状大分子，这一结合是通过功能基如酸酐、叠氮化物、炔基、顺丁烯二酰亚胺等来完成的。超顺磁性氧化铁纳米粒子（IONPs）是另一种常用的MRI造影剂。IONPs适宜的物理化学属性与表面性能已被用于MR成像研究。表面修饰常会提高安全性、生物相容性、稳定性和亲水性，并可形成用于进一步结合的末端功能基。通过高分子聚合物或表面活性剂如聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐、聚乙烯醇（PVA）、聚乙烯亚胺（PEI）和甲硅烷等可形成纳米颗粒表面涂层。已成功制订了各种方法使PEG与纳米颗粒相连，如纳米颗粒聚合作用与表面甲硅烷嫁接法。

（二）示踪Gd（Ⅲ）螯合剂

高自旋顺磁性Gd（Ⅲ）螯合剂可以有效增加T₁弛豫速率（1/T₁），常被用作T₁造影剂，并产生阳性影像对比。体内造影剂通过依附于脂蛋白、线性聚合物、胶粒结构、树状大分子与固体脂质纳米颗粒（SLNs）而被用于显像、放大信号。为了检测凋亡细胞暴露的PS，生物素化的annexin Ⅴ通过亲和素与Gd-DTPA标记的生物素化脂质体共价结合而与其连接。小鼠心脏体外研究心肌细胞凋亡显示，在早期凋亡阶段的心肌细胞区域MRI信号强度明显增加。凋亡细胞annexin Ⅴ结合的造影剂显示明显增加的弛豫速率，这表明靶向纳米颗粒可应用于在体凋亡细胞检测。Gd螯合剂标记的突触结合蛋白Ⅰ的C2A域同样可以检测凋亡细胞，而用于MRI技术检测细胞凋亡。通过直接吸附法制备Gd-DTPA-C2A-GST造影剂，体内T₁加权成像显示肿瘤组较对照组有更多的造影剂聚集。

多肽类与有机小分子也可与Gd螯合剂进行标记，Burtea等通过噬菌体技术确定六肽hexapeptide（LIKKPF）对PS有高度亲和力，由Gd-DTPA复合物标记的hexapeptide可显示动脉粥样硬化斑块中的细胞死亡。

目前，¹H MRI酶活性测定正在进行中。但通过¹H MRI观察酶活性的不足是本底信号干预了探针信号的采集。因此，研究者开始关注一种在动物体内几乎没有本底信号的¹⁹F MRI。Gd-DOTA-DEVD-Tfb是一种¹⁹F MRI探针，可用于检测Caspase-3活性。

（三）氧化铁纳米颗粒凋亡显像

超顺磁性氧化铁纳米颗粒是最具代表性的T₂显像剂，可以有效增强T₂弛豫速率（1/T₂），并产生阴性显像对比。交联氧化铁（CLIO）是一种单分散氧化铁的高稳定性交联衍生物，可用于分子成像。每2.7个annexin Ⅴ蛋白通过二硫键与一个CLIO纳米颗粒相连而成annexin Ⅴ-CLIO，可以作为凋亡检测有效的MRI探针。

C2A结构域作为另一种PS结合方式，可与超顺磁性氧化铁纳米颗粒结合。已有体内、体外实验证明，可用于治疗后肿瘤细胞的凋亡测定。

四、多模态凋亡显像

（一）多模态标记策略

临床上常用的多模式显像包括光学成像、MRI、CT、US、PET和SPECT，它们具有各自不同的解剖与功能成像特点，因此将不同的成像模式进行整合，可以获得不同成像模式的优点，同时降低各自的局限性。

（二）基于纳米颗粒的多模式探针

靶向凋亡的多模式探针已有较深入研究。Schellenberger等研究了磁电机/光学形式的annexin Ⅴ，即Anx-CLIO-Cy5.5的合成过程，将SATAylated annexinⅤ与SPDP激活的荧光CLIO纳米颗粒反应而获得。这种结合方式，可以使体内、体外有效维持annexin Ⅴ与凋亡细胞相互作用的强度，并易于被标准MRI与NIRF光学方法所检测。van Tilborg等发明了annexin Ⅴ结合的双峰纳米颗粒，这些纳米颗粒是由封装在顺磁性微团中的量子点组成的，使其可以同时用于光学成像与MRI。将annexin Ⅴ结合的纳米颗粒用于凋亡检测的特异性已得到了荧光显微镜与MRI的证实，确认了它用于双显像模式在体检测凋亡的潜能。annexinⅤ-CCPM允许体内、体外通过核技术与光学技术显示肿瘤细胞凋亡。研究显示，双标记的annexinⅤ-CCPM有助于评估病情和治疗反应如非正常细胞死亡。Zhang等利用一种基于人类单克隆抗体PGN635，靶向PS的脂质体纳米探针PGN-LIO/DiR，SPIO被装入脂质体的核心，而近红外染料DiR则是亲脂性双分子层的一部分。通过体内、体外纵向MRI与光学成像表明，靶向PS的脂质体可为肿瘤显像剂定向投放、潜在的抗肿瘤药物治疗提供一个有用的平台。然而，使用纳米颗粒进行肿瘤多模态成像仍处于初级研究阶段，需要进一步研发靶向凋亡（PS之外的靶点）的多功能纳米粒子。

（三）小分子多模式探针

小分子标记的不同报告基团可用于多模态成像。有报道称可使用一种光学-核双重模式分子探针显示Caspase-3的活化。分子探针LS498由三部分组成，DOTA用以螯合⁶⁴Cu，一个近红外的荧光团-淬灭剂对、Caspase-3特异的底物肽段。通过体内、体外研究已经证实，使用放射性核素显像可以定位与量化分子探针的分布，使用光学成像可以报告诊断酶的功能状态。标签的相对缺乏限制了探针的使用，然而，在组织中快速扩散的潜力使其在体内应用中具有一定的吸引力。

第四节　放射性核素凋亡显像的应用

一、肿瘤放疗和化疗效果评估

临床上常使用解剖成像如MRI、CT对肿瘤治疗疗效进行评估，然而，通常在治疗后的1～2个月才能发生明显的结构改变，因此，患者需承担接受无效治疗的风险；另一方面，临床试验需要经历很长一段时间才能显示出对治疗的反应。因此，患者与制药业均得益于对疗效的早期评估。通过分子功能水平而非解剖水平获得信息的诊断方法可以对此提供有效的解决方案。近年来，在分子成像方面的技术进步使生物过程在体成像成为可能。大多数抗肿瘤治疗方法通过诱导细胞凋亡对抗肿瘤。研究表明，治疗后早期肿瘤细胞凋亡的程度反映肿瘤组织对治疗的敏感性，并可基于细胞凋亡的程度早期评价治疗的效果、预测疾病的转归。

^99mTc-HYNIC-annexin Ⅴ是目前研究最多的显像剂，多数^99mTc-HYNIC-annexin Ⅴ凋亡显像应用于头颈癌（HNC）、滤泡性淋巴瘤（FL）、非小细胞肺癌（NSCLC）和乳腺癌（BrC）患者。Van de wiele等于2003年首次报道了^99mTc-HYNIC-annexin Ⅴ在肿瘤患者的应用，结果发现肿瘤组织对^99mTc-HYNIC-annexin Ⅴ的摄取与凋亡细胞数成正相关。Lan等发现，荷瘤小鼠环磷酰胺治疗后24小时，治疗组可见清晰的肿瘤组织^99mTc-HYNIC-annexin Ⅴ显像，而在生理盐水对照组小鼠的肿瘤部位只观察到少量放射性标记的示踪剂，肿瘤部位显像较弱（图18-3）。^99mTc-HYNIC-annexin Ⅴ可作为凋亡显像示踪剂，并对化疗后早期疗效进行监测和评估。Yang等利用紫杉醇治疗肿瘤后，^99mTc-ECannexin显像发现肿瘤组织对^99mTc-EC-annexin摄取明显增加。

兔VX2肺癌模型紫杉醇化疗后72小时进行¹⁸F-C2A-GST PET显像，发现治疗组肿瘤¹⁸F-C2AGST摄取明显增加，最大标准摄取值明显高于对照组（0.47 ± 0.28 vs 0.009 ± 0.001；p ＜ 0.001），¹⁸F-C2AGST可作为化疗后早期凋亡的预测指标。Qin等利用¹⁸F-rh-His10-annexin Ⅴ监测A549荷瘤小鼠单次紫杉醇化疗后120分钟图像，结果示治疗后肿瘤组织对¹⁸F-rh-His10-annexin Ⅴ的摄取量较治疗前明显增加（SUV_max 0.35 ± 0.13 vs 0.04 ± 0.02，p ＜ 0.001）。Nguyen等给予荷瘤小鼠环磷酰胺治疗，于治疗后24小时、48小时行¹⁸F-ICMT-11 PET显像，结果显示治疗后24小时，肿瘤组织对¹⁸F-ICMT-11的摄取达到高峰，这与体外实验观察到cleaved Caspase-3活性在24小时达到高峰一致，并通过TUNEL染色证实凋亡细胞存在；且肿瘤组织对¹⁸F-ICMT-11的摄取与¹⁸F-FDG的摄取负相关。¹⁸F-ICMT-11有望成为肿瘤化疗后与Caspase-3相关的一种非侵入性凋亡检测标记物，目前正在进行三期临床实验中。

二、脑梗死的凋亡显像

脑卒中是最常见的神经系统病变，随着对卒中病理生理过程的深入认识，研究者提出了神经血管单元（neurovascular unit，NVU）的概念。NVU包括紧密相关的神经元、内皮细胞和胶质细胞，坏死是脑卒中超急性期NVU细胞死亡的主要形式，然而，凋亡在随后的阶段发挥重要作用。寻找非侵入性、实时监测脑卒中细胞死亡的显像剂对组织损伤区域的评估、治疗的监视发挥重要作用。

¹⁸F-ML-10是一种由¹⁸F标记的小分子PET显像剂，可与凋亡细胞外翻的PS结合。Reshef等于大脑中动脉（middle cerebral artery，MCA）阻塞小鼠（MCAO mice）模型建立后24小时给予小鼠注射¹⁸F-ML-10，并行动态PET扫描。结果显示，缺血MCA区域¹⁸F-ML-10摄取明显增加。体外研究结果表明，受累大脑半球¹⁸F-ML-10吸收剂量较对照组增加2倍，梗死区¹⁸F-ML-10吸收剂量较对照组增加6～10倍，且脑组织对¹⁸F-ML-10的摄取与细胞死亡的组织学证据相关。表明¹⁸FML-10显像有助于描述缺血相关的脑组织损伤区域，监测疾病的发展与治疗效果。

Zhang等首先建立了兔左侧大脑中动脉缺血-再灌注模型，于再灌注21～24小时后静脉注射^99mTc-labeled duramycin，并于注射后1～2小时行脑动态SPECT显像。TTC染色评估病灶体积，cleaved caspase-3染色观察细胞凋亡。结果示，模型动物左侧大脑半球有明显的放射性浓聚（热点），对^99mTc-labeled duramycin的摄取明显高于右侧大脑半球，缺血部位对其摄取的多少与缺血程度相关。放射自显影结果示，TTC染色阴性区域与大脑放射性浓聚区一致，TTC染色阴性区域代表缺血半暗带，免疫组织化学结果同样显示cleaved caspase-3阳性染色主要存在于缺血半暗带。实验结果表明，^99mTc-labeled duramycin SPECT显像可用于大脑缺血-再灌注引起的凋亡神经元的检测和定量。

三、心肌细胞凋亡显像

心血管疾病是当今世界发病率与死亡率最高的疾病。临床实践中，体内识别引起心脏病发作的动脉粥样硬化病变依旧困难。成像技术为检测有临床意义的冠脉粥样硬化改变提供了参考标准。在心肌缺血再灌注过程中，凋亡是引起再灌注损伤心肌细胞死亡的重要形式。

Thimister等在AMI急性期行^99mTc-MIBI心肌灌注显像，结果显示，所有AMI病例均见心肌梗死部位为放射性缺损区，PTCA术后^99mTcannexin Ⅴ显像结果示这些区域为放射性浓聚区。亚急性期（心梗发作4天后）^99mTc-MIBI心肌灌注显像示放射性缺损区较急性期明显缩小（9%～43% vs 3%～25%，p ＜ 0.05），但仍与 ^99mTc-annexinⅤ放射性浓聚区一致。部分病例亚急性期^99mTcannexin Ⅴ摄取较急性期不断减少，甚至不摄取，即此时^99mTc-annexin Ⅴ凋亡显像阴性，之后，心肌灌注显像结果完全正常。这些均表明，急性期^99mTc-MIBI放射性缺损与^99mTc-annexin Ⅴ放射性浓聚与可逆性心肌损伤相关。若^99mTc-annexin Ⅴ显像显示有心肌细胞凋亡存在，则可通过凋亡抑制治疗来防止心肌细胞死亡，同时可对治疗效果进行评价。

为评估心肌梗死的治疗效果，将心肌梗死小鼠分为生理盐水对照组与PTH治疗组，术后2天行⁶⁸Ga-annexin A5 PET显像，术后6天，30天行FDG-PET检查评估左心射血分数与梗死区域。结果示，术后2天对照组梗死区⁶⁸Ga-annexin A5摄取值高于治疗组（7.4%ID/g ± 1.3%ID/g vs 4.5%ID/g ±1.9%ID/g，p = 0.013），TUNEL 染色结果示对照组梗死区细胞凋亡数明显高于治疗组（64% ± 9% vs 52% ± 4%，p = 0.045），FDG-PET 示治疗组梗死区面积明显降低，而对照组增加。实验表明，⁶⁸Gaannexin A5 PET可以作为凋亡标志监测PTH对MI的治疗效果。

此外，凋亡显像也用于动脉粥样硬化斑块的显像，用于在体显示不稳定斑块的巨噬细胞或平滑肌细胞的凋亡过程，黄代娟等研究表明，应用^99mTc-HYNIC-annexin Ⅴ动脉粥样硬化斑块显像，在不稳定性动脉粥样硬化斑块部位显像剂摄取明显增高（图18-4）。

四、新生儿缺氧缺血性脑损伤细胞凋亡显像

新生儿缺氧缺血性脑损伤（hypoxic-ischemic brain injury，HIBI）发生后脑部微循环相对小的波动就会引起细胞凋亡。坏死与梗死会导致脑细胞立刻发生不可逆性损伤，而新生儿HIBI引起的凋亡要经历一段时间发展、变化，是脑细胞迟发性死亡的重要形式，这种类型的脑细胞死亡可能是脑瘫的预兆。凋亡的发展需经历多级过程，阻断凋亡的级联反应就可能中断细胞程序性死亡。通常脑瘫患儿的症状在2～3岁才逐渐显露，因此，若在疾病发生早期便可监测到细胞凋亡，就可尽早给予治疗。

D’Arceuil等对新生兔HIBI模型进行^99mTcannexin Ⅴ凋亡显像，结果显示，模型组兔脑组织有局灶性^99mTc-annexin Ⅴ摄取，小脑摄取最多，对照组无摄取。而MRI检查未见缺血后血脑屏障崩解与灌注异常。

五、其他

凋亡显像在疾病诊断与疗效预测方面的优势有助于个体化治疗的发展，对药物开发也发挥重要作用。

甲状腺炎、药物引起的肝细胞凋亡均可用annexin Ⅴ评估，另外，药物所致心肌毒性引起的细胞凋亡可用¹⁸F-CP18进行评估。

小 结

凋亡是细胞死亡的一种重要形式，有效的放化疗后可引起肿瘤细胞的凋亡。临床前研究与临床研究表明凋亡显像可以用来检测有效治疗后肿瘤细胞的早期凋亡，从而判断肿瘤治疗后的早期疗效。随着人们对凋亡生物学过程的认识深入，设计靶向细胞凋亡的多模态探针成为可能。基于纳米颗粒、蛋白质、肽段、小分子多肽的凋亡成像模式探针，体内凋亡成像对临床的发展起着重要作用。然而，由于开发临床应用的显像探针存在困难，迄今为止，还没有任何一种显像剂进入临床应用。总体来说，一个有临床应用潜力的凋亡显像探针应具有以下特性：①凋亡细胞高选择性、高特异性；②体内、体外具有高稳定性；③合适的药代动力学；④与成像设备、标记技术具有兼容性；⑤低免疫原性与毒性；⑥经济上可行。凋亡检测为研究者与临床医生提供了疾病治疗的新视角，相信在不久的将来一定会有一种或多种分子探针能够克服药物研发阶段的各种困难而最终进入临床应用。

（宋少莉）

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