第十七章　受体放射分析

放射配基结合分析直接测定配基和受体的复合物，方法较简便，敏感性高，特异性强。如果放射性标记配基制备恰当，可以不改变原有配基的亲和力。因此用途广泛，有些方面如受体数量的测定是迄今为止其他方法无法取代的。

第一节　受体和配基结合反应的基本规律

受体和配基的可逆性结合反应决定了它们服从可逆性化学反应的质量作用定律（mass action law）。设配基和受体的初始浓度为LT和RT，反应一段时间后部分配基和受体结合成复合物，其浓度为RL，未结合的（游离）配基和受体浓度减少到L和R，形成复合物的速率为v₁，其结合速率常数（association rate constant）为k₁。因为是可逆反应，RL又要解离成R和L，设解离速率常数（dissociation rate constant）为v₂，其解离速率常数为k₂。于是按照质量作用定律，有如下关系式（公式17-1）：

其中 v₁ = k₁ × R × L，v₂ = k₂ × RL。当反应达到平衡时，v₁ = v₂，于是 k₁ × R × L = k₂ × RL，习惯上把k₁/k₂称为平衡结合常数KA（equilibrium association constant），也称平衡亲和常数（equilibrium affinity constant）。其倒数k₂/k₁则称为平衡解离常数KD（equilibrium dissociation constant）。在受体研究领域中常用KD来反映亲和力（affinity）的大小，KD越大亲和力越小。因为配基和受体的初始浓度LT和RT分别有一部分变为RL，所以L = LT - RL，R = RT - RL，所以有以下等式（公式 17-2）。

不论用放射配基结合分析解决什么问题，有两个共同性的问题必须先行处理好。一是测定到的复合物放射性，称总结合（total binding，TB），包括配基和受体的特异结合（specific binding，SB）及非特异结合（nonspecific bind，NSB）两部分，必须将TB减去NSB得到SB，才代表受体的特异结合。二是实验测定的是复合物的放射性，需要将放射性换算成受体的量（通常以mol数表示）。

NSB由标本中的杂蛋白及分离复合物的材料引起，属低亲和力、高容量，故随LT增加而线性上升，不被非标记配基取代。如实验时作平行管，管内除放射配基和受体外还加100～1 000倍浓度的非标记配基，则该管内的SB绝大部分被非标记配基取代，而NSB不被取代，故该管测得的放射性代表NSB。相应的TB管放射性减去NSB管放射性就是SB（图17-1）。

SB的放射性实际上来自配基，单位是cpm，所以可先按公式17-3换算成配基的mmol数。

多数受体和配基以1∶1的比例结合，则配基的mmol数亦即受体的mmol数。如果一个受体分子结合两个分子配基（如烟碱样胆碱受体），或者两个受体分子结合一个分子配基（如生长激素受体），则再按该比例计算受体量。如再除以管中的细胞数或蛋白量，就是通常所谓的受体密度。蛋白量需另设平行管测定，常用的方法是Lowry法和考马司亮蓝法，后者只适用于可溶性蛋白。

下面介绍的放射配基结合分析法都是以已减去NSB，并已换算成受体的mmol数为起点。

一、饱和曲线法测定受体的数量和亲和力

配基和受体的结合服从可逆反应的质量作用定律，其基本方程将公式17-2展开重排，就得到饱和曲线的方程（公式17-4）：

实验时取一系列试管，各加相等量的受体标本RT，同时向各试管中加不同量（从0起逐管递增，尽量覆盖饱和区）的放射配基LT，孵育一定时间使反应达到平衡（正向和反向的速率相等），分离复合物测放射性RL，就得到饱和曲线。将各点的LT作为自变量、RL作为应变量代入17-4式，经过计算机曲线拟合就可得到饱和曲线，并给出RT和KD。

应当指出：①放射配基的选择对获得可靠结果非常重要。很多标本都含有同一种受体的不同亚型，如果用选择性放射配基，而选择性又不很高，则难以保证所选浓度对各种亚型都已达到饱和区（图17-2）。因此应当选择无选择性的放射配基，得到的是该种受体各亚型的总量。如要测定某种亚型的量，应选用后面将述及的双位点法；②由于受体密度和蛋白量有关，而杂蛋白量的多少和所用匀浆方法、离心介质和速率有关，所以各实验室的正常值不会等同，即使同一实验室所得数据也应当用同批配对的方法作统计处理。

二、受体与配基结合反应的动力学

上述求RT和KD的方法要求反应达到平衡后才能分离复合物测定，达到平衡需要一定孵育时间，这个时间和孵育温度及k₁、k₂的值有关。可以通过动力学实验求得。受体与配基开始接触，v₁ = k₁ × R × L 由最大逐渐变小，v₂ = k₂ × RL 由最小逐渐变大，复合物的净生成率是v₁-v₂，所以开始时复合物增长很快，逐渐变慢，当v₁ = v₂时就不再增长，也就是达到动态平衡。一般达到平衡都较快，在数十秒至数十分钟间。当周围的游离配基急剧下降，或非标记配基浓度急剧升高时，放射性复合物的解离也很快，而且服从一级动力学（图17-3）。这种快速结合和快速解离对保证受体的迅速反应有很重要的意义。

三、通过Scatchard函数判断结合反应属简单单位点系统还是较复杂的系统

将公式17-2写成KD =（RT - RL）× L/RL再进行简单的重排，即得到著名的Scatchard函数（公式17-5）：

可以看出，当RT和KD固定时，RL/L和RL是线性关系，若以RL为横坐标，以RL/L为纵坐标，将得到一条直线。横截距即为RT值，直线斜率的负倒数就是KD（图17-4）。所以在没有计算机曲线拟合的程序时Scatchard函数也可用来对多点法实验求RT和KD。但是由于直线化需进行坐标转换以及横坐标RL本身是实验值，所以Scatchard作图法求RT和KD往往误差较大。类似的直线化方法还有Woolf函数和双倒数函数，也有类似缺点，现已少用。

如果反应系统中配基和受体有两种以上的亲和力，则Scatchard函数作图不是一条直线，所以Scatchard函数作图迄今仍被用来帮助判断系统中是否存在二种以上亲和力。当有两种受体亚型对配基亲和力不同时，将呈现为向上凹的曲线。当系统存在正协同（positive cooperativity）或负协同（negative cooperativity）现象时，将分别呈现向上凸或向下凹的曲线。所谓协同现象，就是当一个受体结合位点和配基结合时，会影响邻近结合位点的构象，使它和配基的亲和力发生变化（KD变大或变小），而且这种变化随着受体和配基结合量的增加而越来越显著，受体调节一章中还将进一步讨论。

四、用Hill函数作图求Hill系数

用Hill函数作图求Hill系数帮助判断系统中是否一个分子和一个配基分子结合，如果每一个受体分子与n个配基分子结合，则按质量作用定律有以下关系式：该式也可写成该式重排，两边取对数，就得到Hill函数（公式17-6）：

当以LogL为横坐标，LogRL/（RT-RL）为纵坐标作图时，为一上升直线，这就是Hill作图（图17-5）。斜率为n，称为Hill系数。如果受体分子与配基分子以1∶1结合，则n = 1，如以1∶2结合，则n = 2。有时n介于0.5和1或1和2之间，则往往和Scatchard函数作图时呈曲线相仿，提示有两种以上亲和力的存在，或由于有两种以上亚型，或由于有正负合作现象。

五、用竞争性取代反应比较不同配基对受体的亲和力

如果在放射配基和受体的反应系统中加入另一种不带标记的配基，而且该配基也能和受体发生特异性的可逆性结合，则会与放射配基竞争有限的受体结合位点，使放射配基形成的复合物减少，减少的程度和所加配基的亲和力及浓度有关。这就是竞争性取代反应（competitive replacement reaction），也称竞争结合反应（competitive binding reaction）。竞争取代反应也是动态过程，也需要一定时间才达到平衡，由于系统中有两种配基，所需平衡时间较长，而且在很大程度上取决于亲和力较低的配基。

以所加的竞争剂浓度（绝对值或以不加非标记配基时为100%的相对值）为横坐标，复合物的放射性为纵坐标作图，将得到一条逐渐下降的曲线，若改用竞争剂剂量的对数为横坐标，将得到一条反S形的竞争曲线。越是亲和力高的非标记配基，曲线下降越快，S形曲线的位置越是在图的左侧（图17-6）。

图中还给出了IC₅₀，亦即取代50%时的非标记配基浓度，浓度越小，说明非标记配基的竞争性越强，亦即亲和力越高。此处是指竞争剂的亲和力，用KI表示。IC₅₀的大小除和非标记配基的亲和力有关外，还和所用放射配基的亲和力及浓度有关，KI则是非标记配基的常数。两者可用公式17-7进行换算。

用竞争性取代反应比较不同配基对受体的亲和力，只需一种放射配基就可以观察很多不同的非标记配基，所以很明显，对筛选受体的拮抗剂和激动剂有重要用途。

六、用双位点饱和实验研究受体亚型

前已述及，如果一个标本中有两种亚型，而且它们对配基有不同亲和力，则用多点法作饱和曲线实验，每一个LT给出的RL都是两种亚型的总和，而且两种亚型的比例随LT的增加而不断改变（图17-4）。遇到这种标本，如果只需要了解总受体数，可以改用无选择性的放射配基，给出总的RT和总的KD。如果需要了解不同亚型的RT和KD，则必须选用有选择性的放射配基，借助一定的数学模型和计算机程序，求出高亲和力受体亚型的RT₁和KD₁以及低亲和力受体亚型的RT₂和KD₂。

由于计算机编程的具体需要，双位点饱和实验的数学模型需从Scatchard函数开始。将Scatchard函数写成如下形式（公式17-8）：

当系统中有两种亚型，测得的RL是RL₁和RL₂的总和，RT是RT₁和RT₂的总和，各自的亲和力分别用KD₁和KD₂表示，于是得到双位点饱和曲线的Scatchard函数如下（公式17-9）：

上式中RL和L是实验值，RT₁和RT₂、KD₁和KD₂是待求参数。只要实验点数足够多（10点以上），得到足够多的RL和L，就可以通过曲线拟合，求出曲线并分解成高低亲和力两条直线，同时给出四个待求参数（图17-7）。也可以进一步还原成饱和曲线。用双位点饱和实验的主要缺点是低亲和力受体亚型不易饱和，加以Scatchard函数作图需要坐标转换，因此误差较大，而且所需放射配基量大，成本高。所以研究亚型用得更多的是双位点竞争取代反应。

七、用双位点竞争取代反应研究受体亚型

为了克服双位点饱和实验的缺点，也可用双位点竞争取代反应来研究受体亚型的参数。用非选择性的放射配基和所有受体亚型结合，用有选择性的非标记配基进行竞争取代反应，则两种亚型对非标记配基有高低亲和力之分。非标记配基浓度低时取代的多为高亲和力亚型，随着非标记配基浓度增加，被取代的低亲和力亚型逐步增多，形成一条非典型的中间有转折的竞争曲线。两种亚型和非标记配基的亲和力差异越大，转折越明显（图17-8）。为了建立数学模型，以便用计算机求解两种亚型的参数，我们参照Molinoff的报道推导出以下方程。实验的做法和单位点竞争取代反应基本相同，得到一系列对应于各个IT的RL。以不加IT时的RL减去其他各管的RL即得到一系列对应于IT的RI。于是公式17-4～公式17-6中四个待求参数就可通过拟合算出。再按公式17-7算出KI₁和KI₂，通过公式17-10得出RI。图17-9是一个M受体的实例。

上述两种处理双位点的方法都是对高亲和力亚型的误差较小。它们也可用于多位点系统，但此时所选非标记的竞争剂应当只对其中一种亚型具有高亲和力，而对其他亚型都是低亲和力。例如pirenzipine只对M₁亚型有高亲和力，对其他4种亚型都是低亲和力，因此用同样的程序将竞争曲线分为高低亲和力两条曲线，高亲和力的一条就代表M₁，低亲和力的一条是4种亚型的混合，没有意义。如需求M₂亚型的参数，则应改用对M₂有高亲和力的甲氧曲胺（methoxytyramine）。

综合以上7个方面，可以看到，放射配基结合分析用途广泛，能较精确地求出有关受体的很多参数。因此直到目前仍是研究受体极为常用而且非常有用的方法。

第二节　受体放射分析的基本方法

建立一个优良的离体RBA系统，应根据实验目的和研究对象而有不同，在方法学上考虑的要点如下。

一、受体标本的制备

在受体结合的实验研究中，所用的受体标本为组织切片、完整的单层培养细胞或游离活细胞、粗制的或纯化的细胞膜受体，以及可溶性的受体蛋白等。

1.组织切片

冷冻组织切片常用明胶粘贴于玻片上，在温育缓冲液中与标记配基进行反应，反应结束后用冰冷缓冲液洗去未结合的多余标记配基即可，切片厚度一般为8～50μm。用组织切片的主要目的是研究受体的分布，即用放射自显影法或免疫组织化学法。

2.游离的完整细胞悬液

完整活细胞可以是血细胞、培养的单层细胞、肿瘤的腹水细胞或经处理的原代细胞等。完整细胞的优点是在研究受体结合特性的同时进行生物效应的测定。完整细胞的膜受体在37℃时会发生受体内化现象（internalization），这会破坏结合反应的平衡状态，在此情况下测定的KD值就不正确。如EGF受体，完整细胞在37℃温育时约有80%的受体内化，而在4℃温育，内化现象可被阻止。使用完整细胞的优点可归纳为：①受体处于原有的正常环境，膜、膜内pH、离子梯度等均未受扰乱，受体与其相连的效应器（如G蛋白）也保存完好；②在受体功能完好的情况下研究受体，可以同时观察配基与受体的结合以及细胞的生物效应，所得结果更能反映受体的生理特性；③能直接给出每一个细胞的受体数。

但完整细胞的受体分析必须尽可能选用不易穿透细胞膜双层磷脂的标记物，否则由于游离配基进入细胞内可引起较大误差。此外还必须注意防止操作过程可能导致细胞表面生理活性的改变。

3.分离亚细胞组分

大多数受体的RBA需经差速离心法分成胞膜、胞质、胞核，取所需的组分进行分析。其优点是：①除去大部分杂蛋白和内源性配基，减少NSB或其他干扰因素；②受体蛋白得到初步浓缩，使富集的受体制剂获得可靠的分析结果。

亚细胞组分（即细胞膜和细胞质受体）的分离一般都采用差速离心法。一般先制成匀浆，再在含0.25～0.3mol/L蔗糖的缓冲液中先后以不同离心力进行离心，分离不同的亚细胞组分。为保证受体标本的结合活性，整个制膜过程必须在4℃下操作；缓冲液应有适宜的离子强度、pH值、EDTA和Mg²⁺等；有时需加蛋白酶抑制剂，防止受体蛋白被内源性蛋白酶水解。分离的细胞组分如图17-10所示。

受体组织的来源主要是实验动物或人，在血液供应停止后必须尽快取材。以防组织自溶的影响。必须注意及检验组织冷冻对受体结合的影响。一般来说，保存膜制剂比保存整块组织更好，有些受体的膜制剂于-70℃可保存数月之久，但严禁反复冻融。

（1）粗膜制剂（crude membranous preparation）：

冷冻的组织块切碎后加低渗缓冲液进行匀浆。低速离心（800～3 500 × g）10～15 分钟，上清液再高速离心（10 000～30 000 × g）10～15 分钟（均在4℃下进行）。所得即为膜制剂或粗膜制剂。两次离心的好处是可更好地去除可溶性物质（如内源性配基、GTP等），以免干扰结合分析。

（2）洗膜制剂（washed membranous preparation）：

有时上述粗制剂经洗膜步骤后可有效进一步降低非特异结合及内源性配基的结合。但洗膜过程必须防止受体蛋白的分解。目前抑制受体蛋白分解作用的主要方法有：①用新鲜组织；②低温状态下操作膜的制备；③加蛋白酶抑制剂。

洗膜制剂的方法各家报道不一，较多的是反复高速离心，有的加用EDTA，有的中间增加冰浴振荡最后得到的沉淀可-70℃保存数月之久。膜制备过程中以及制成品应以受体结合试验（与标记配基的结合率）及酶活性作指标来判断膜制剂的纯度。还可用电子显微镜观察膜制剂有无其他亚细胞组分。

4.可溶性受体蛋白

大多数跨膜受体用1%（V/V）TritonX-100能有效地将受体蛋白从双脂层中溶解出来，也有用Digitonin或Tween-80等物质来溶解。溶解受体时常加蛋白酶抑制剂以保护可溶性受体蛋白不被水解。一般用100 000 × g的超速离心法分离可溶性和不可溶性的物质。所有操作都应在4℃下进行，以免受体蛋白产生凝结、变性。假如受体蛋白还需进一步纯化，常用特异的配基或抗体，以亲和层析法分离受体蛋白。

二、标记配基的选择

受体的放射配基结合分析法没有标准品作参照，而是通过已知放射配基的放射性活度和比活度，以及测定结合部分的放射性活度，用数学模型求出受体的有关参数。因此对所用的标记配基有很严格的要求。

1.对放射配基的基本要求

（1）高比活度：

由于RBA的标本中受体数量一般都很低，在0.01～1pmol/mg蛋白的水平，要得到满意的结果就必须使用高比活度的标记配基。一般要求比活度在 3.7 × 10¹¹Bq（10Ci）/mmol以上。比活度高，可减少加入反应管的放射配基量，对标本量少的实验尤为重要。

（2）高亲和力：

亲和力高的标记配基在浓度较低时便可达到饱和，因此可节省用量。此外，这种配基与受体形成的复合物往往解离较慢，有利于结合和游离配基的分离。不少拮抗剂的亲和力比激动剂高，因此使用较多。

（3）高特异性：

与其他种类的受体交叉反应要尽量少，否则需要采取措施预先除去标本中有交叉反应的受体。对于有两种以上亚型的标本，还需注意配基对亚型的选择性。例如脑标本内有5种M受体的亚型，如果目的是测定总的M受体密度，则应选对5种亚型都没有选择性的配基；如果目的是测M₁亚型，则应选只对M₁有高亲和力而对其他亚型都只有低亲和力的标记配基如哌仑西平做饱和实验，或选非标记哌仑西平做竞争取代实验。

（4）高放射化学纯度及高稳定性：

RBA中受体参数的计算是以标记配基的用量和比活度为依据，较多的放射性杂质有时可导致计算错误。一般要求放化纯度在95%以上。

2.对放射配基的用量

不同受体、不同配基、不同实验方案所需的放射配基用量差异可以很大，需通过预实验来选定。

（1）多点饱和曲线实验：

每一受体标本做6～8个实验点（双位点需更多些），逐点增加标记配基的量，低剂量应覆盖不饱和区，高剂量应覆盖饱和区，以便得到较典型的饱和曲线。此法能给出较多参数，如RT、KD、反映实验误差大小的平均残差等，可信度也较高，但工作量较大。

（2）单点法：

通常根据多点饱和实验结果来选定一个能与受体基本饱和结合的标记配基量，根据结合部分的放射性活度算出受体结合位点的摩尔数。该方法操作简便，所需标本量少，适宜临床检验和药物筛选，但只能给出一个参数即受体的最大结合容量Rmax，而且所得结合容量略小于饱和曲线法。

（3）竞争结合实验：

如果竞争结合实验是为了判断非标记化合物属竞争抑制剂还是不可逆阻断剂，所用放射配基是从零开始逐渐增大，和一般饱和实验相同。如果目的是比较不同竞争剂的亲和力大小，实验中改变的是IT，而LT是固定值。对此类实验，要求LT远大于RT，否则由KI转换成IC₅₀将有明显误差。

三、非标记配基的选择

非标记配基有两个作用。一是测定NSB，二是在竞争取代反应中作竞争剂。测定NSB时的方法是：在测定上述多点法或单点法的总结合TB时，同时设置一系列平行管，在加入标记配基及受体标本的同时，另加非标记配基，后者可以是标记配基的同一化合物，也可以是该受体的另一种配基。但必须能与标记配基竞争同一受体，并且非标记配基对受体的特异性和亲和力应尽较高，使之有较高竞争能力。一般非标记配基的用量为标记配基的500～1 000倍，可占据几乎所有的受体位点，使绝大多数受体不再与标记配基结合，这样，测得的结合部分放射性就代表非特异结合（NSB）。

测定NSB时，所需的非标记配基浓度一定要通过实验来选定。因为，如果浓度不足，则对受体位点封闭不够；如浓度过高会使一些非特异性结合位点被占据，产生特异性结合（SB）被抑制过多的假象。另外，所用非标记配基最好和放射性配基不是同一化合物，这样不容易出现非特异性结合位点被占领的情况。

四、温度与孵育时间

温度是影响反应速率的重要因素。温度高，结合快，达到反应平衡时间短。但温度低，反应终止时容易降温，减少分离过程中复合物的解离。另外，温度低对配基及受体的稳定性有利，但原有的内源性配基不易解离。不同受体结合系统的最佳温育温度要经过试验选定。

对于饱和或竞争取代试验，反应达到平衡的时间较长，故温育时间应比简单的饱和实验长。温育温度与平衡时间是紧密相关的，不同的受体结合系统的反应平衡时间因亲和力、温育温度、配基及受体浓度的不同而不同。必须注意，在测试最佳温育时间时，应以低浓度的放射性配基为准，因为低浓度配基更不易达到平衡。

一般室温操作比较方便（22℃），但有人认为使用生理温度37℃更好，活细胞的膜受体存在内化（internalization）问题。4℃温育，平衡时间虽然长一些，但其结果之重复性更好。

五、结合与游离部分的分离

RBA流程中分离的目的是将反应达到平衡后所形成的标记配基和受体的复合物与游离标记配基分开，然后才能测定复合物的放射性活度。一旦分离，原有的反应平衡被破坏，因此在分离过程中要使复合物的解离降低到最低程度。低温和快速是最有效的措施。常用的分离方法有过滤、离心、吸附、透析、电泳等，凡RIA中用的分离方法基本都可以采用。

1.对完整细胞、胞膜、胞核受体样本的分离，目前最常用的分离方法是过滤法。过滤材料主要是玻璃纤维滤膜，此法操作简便、分离效果较满意。但是对有些游离的标记配基有非特异吸附能力，使NSB升高，需要采取一定措施例如预先用牛血清白蛋白、非标记配基或PE（Ipolyethylenimine）等浸泡。对于KD较大亦即亲和力较低的受体反应标本，过滤过程可能引起较多的复合物重新解离，导致较大误差。对此，可以考虑改用离心法，原因是离心过程并没有破坏原来的游离配基和复合物的平衡。但是离心法不能完全去除游离配基，因此NSB较高而且波动较大。

2.对溶脱的核受体、存在于胞质中的核受体以及溶脱的膜受体样本，往往采用葡聚糖涂膜活性炭法（DCC，终浓度0.5%左右）来分离。DCC将游离配基吸附并离心除去，受体复合物留在上清液中，因此分离过程也会造成原来平衡的破坏。必须在低温下进行，而且严格控制每一反应管的分离时间相同。对低亲和力的可溶性受体，DCC不是理想的分离方法，近年来出现了不少利用小层析柱的方法，和上述颗粒性标本利用离心法的原理相仿，以减少在分离过程中平衡的破坏。

第三节　受体放射分析的数据处理

受体放射分析所得测定数据都是放射性强度单位，如cpm，dpm等，而受体分析没有标准品，不能通过标准曲线查到所需结果，只能靠数据换算来解决。如换算成每毫克蛋白或10⁶细胞所含受体数（通常以fmol或受体分子数表示）或平衡解离常数（通常以nmol/L表示）。另外，较多的受体放射分析是各种多点法（如单位点或双位点的多点饱和分析法，单位点或多位点的竞争结合分析法等），实验得到的是若干点的实测值，需要经过用一定的数学模型进行直线或曲线拟合，才能得到所要的结果。所以受体放射分析的数据处理包括两个方面，一是正确的单位换算，二是各种手工或计算机的数据拟合。下面将逐一介绍。

一、单点饱和分析法的单位换算

单点饱和法只能得到受体最大结合位点数RT（或称受体密度）。是将测得的复合物放射性强度cpm换算成受体的fmol数，再算成RT（fmol/mg蛋白）。通常都是计算饱和区的RT，也称最大结合容量 Bmax（maximum binding capacity）。因为多数复合物中受体和配基是1∶1的关系，所以单位换算的公式是（公式17-11）：

如果受体和配基以1∶2的关系形成复合物，则上式还应被2除。注意上式中分子是样本的特异结合，实际测量到的总结合TB和非特异结合NSB，TB减去NSB才是样品的特异结合SB。配基比活度的通用单位是Bq/mmol，此处应先换算成dpm/fmol。样本的蛋白浓度需用生化方法测定，主要是两种方法，即Lowry法和Bradford法。前者包括一步强碱处理，适用于可溶性及颗粒性蛋白，后者只适用于可溶性蛋白，用于颗粒性蛋白时误差较大。定出蛋白后就可将RT计算成fmol/mg蛋白。对于完整细胞，也可不测定蛋白浓度而是对细胞数进行计数，得到的RT值以fmol/10⁶细胞数或受体分子数/10⁶细胞表示（1fmol = 6.02 × 10⁸个分子）。

若测得复合物的放射性是2 000cpm（已扣NSB），受体以1∶1分子比例关系与配基结合，标记配基的比活度是1.85 × 10¹²Bq/mmol（= 111dpm/fmol），仪器的测量效率是30%，则标本中的受体量计算如下：

如果该样本的受体密度欲以每毫克蛋白为单位，则60fmol除以实测蛋白的毫克数即可。如果欲以每一细胞所含受体数表示，则fmol应进一步换算成受体数。因为每mmol物质所含分子数是常数（6.02 × 10²⁰或近似 6 × 10²⁰），故标本所含受体分子数为 60 × 10^-12× 6 × 10²⁰ =360 × 10⁸

若标本细胞数是 7.5 × 10⁶，受体密度 = 360 ×10⁸/（7.5 × 10⁶）= 4 800/细胞。

二、多点饱和分析法求受体的密度和亲和力

目前数据处理都通过预先编程的计算机来完成。受体数据的手工计算很费时间和精力，并且都是将曲线直线化后来进行数据处理，结果误差较大。由于计算机技术的高度发展和应用的普及，加之已有不少成熟的受体数据处理应用软件，可对曲线直接进行拟合，得到的结果更为科学可靠。而且使用方便，所以现都采用计算机软件处理。例如国外常用的LIGAND软件包，国内上海交通大学医学院编制的受体数据软件包等可以调用。

因此很少再用坐标转换的方法如Woolf函数、Lineweaver-Burk函数来计算RT和KD值。Scatchard作图和Hill作图虽然还是应用，但目的不是求RT和KD，而是考察实验结果是否符合不区分亚型的简单单位点数学模型。主要模型的函数式都来自质量作用定律，推导过程相对简单，详见本章第一节“受体和配基结合反应的基本规律”。

标记配基饱和法 多点饱和结合实验求受体的密度和亲和力，配基浓度应在0.1～10KD范围内经过预实验加以挑选，覆盖非饱和区和饱和区。计算程序通过稳健回归或最小二乘回归直接给出RT和KD，并可根据使用者的要求打印原始数据、中间运算数据、运算结果及曲线图。例见表17-1～表17-3及图17-11。如有需要也可指令计算机打印Hill函数和Scatchard函数的作图。

（胡雅儿）

参考文献

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