自从1960 年美国学者Yalow 正式发表了采用放射免疫分析法（radioimmunoassay，RIA）测定血浆胰岛素以来，激素等超微量物质的分析获得了一次革命性的突破，极大地推动了内分泌学等生命科学的发展。因为血和尿中大多数激素的浓度较低，通常在10 ^-12～10 ^-6mol/L，而激素水平的微小改变，通常比典型的体征和症状能更早、更敏感和更特异性地反映疾病的发生和发展。因此，半个多世纪以来，基于免疫分析方法的内分泌激素测定，在内分泌疾病的早期发现、早期诊断、疗效判断和预后评估中发挥着重要的作用。但是随着免疫分析技术在临床上的广泛应用，这种基于抗原抗体特异性结合原理技术的一些缺陷也逐渐显露出来，比如测定结果容易受到机体自身抗体、异嗜性抗体等的影响；只能测定激素的免疫活性，不能反映激素的生物活性；测定结果不能反映激素序列的改变。近年来，随着分子生物学技术的发展，各种检验新理论和新技术的不断涌现，色谱和质谱技术被逐渐应用到内分泌激素的检测中，尤其是将色谱的高效分辨能力和质谱的特异、灵敏、多组分检测能力有机结合的液相色谱-串联质谱技术（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）逐渐成为内分泌激素检测领域最有生命力的新技术之一。随着质谱仪灵敏度的不断提高、样品处理技术的持续改进、标准化方法和试剂的逐渐开发，LC-MS/MS 方法将逐渐成为内分泌激素检测，尤其是小分子类固醇激素检测的重要手段。

内分泌学是一个高度依赖于准确的实验室测量的医学。本章主要介绍目前在临床上广泛应用的基于抗原抗体相结合原理的免疫分析技术，其次介绍目前逐渐开展，未来将会有广泛应用的LC-MS/MS 技术。最后，对这些技术方法在方法学判断上的一些注意事项也将做简要的介绍。

免疫分析法是利用抗原和抗体特异性结合产生免疫反应的原理，对待测抗原或者抗体进行定性、定位、半定量和定量的技术（图1-2-1）。该技术对于内分泌疾病的基础研究和内分泌疾病的预测、早期诊断、鉴别诊断以及疗效评估等发挥越来越重要的作用 ^[1～3]。

根据标记物性质的不同，可将免疫分析法分为放射性核素和非放射性核素标记两大类。前者包括RIA 和免疫放射分析（immunoradiometric assay，IRMA），后者主要有酶免疫分析（enzyme immnunoassay，EIA）、荧光免疫分析（fluoroimmunoassay，FIA）和化学发光免疫分析（chemiluminescence immune assay，CIA）。根据检测原理的不同，可以将免疫分析分为竞争性结合分析法（比如RIA）和非竞争结合分析法（比如IRMA）。EIA、FIA、CIA 既有竞争性结合分析法，也有非竞争结合分析法 ^[1～3]。

RIA、IRMA、EIA、FIA、CIA 均属于将标记物的灵敏度和抗原与抗体的特异性相结合的超微量分析技术。RIA 和IRMA 最常用的标记物为 ¹²⁵I或 ³H 放射性核素，EIA、FIA 和CIA 则分别用酶、荧光素和化学发光剂作为标记物。抗原（antigen，Ag）或抗体（antibody，Ab）被标记物标记为标记抗原（Ag ^*）或标记抗体（Ab ^*）后，既不影响抗原或抗体免疫反应的特性，也不改变标记物本身的活性，但却可明显提高测定的灵敏度。例如：RIA 和IRMA 免疫反应终点的判断是γ 计数器（测 ¹²⁵I）或液体闪烁谱仪（测 ³H，简称β 计数器）探测游离（free，F）或结合（bond，B）的标记抗原或抗体的放射性，单位是每分钟计数次数（count times per minute，cpm）。最常用的放射性核素标记物为 ¹²⁵I 或 ³H，其比活度即每毫原子的衰变数分别为2 000Ci/m 和2.9Ci/m 原子。通过用计数器计数放射性核素标记物质的放射性比活度，则能准确定量标记物的含量 ^[1～3]。

用酶标记的抗原或抗体进行EIA，则在免疫反应完成后，加入相应的无色底物，待酶催化呈色后，再用分光光度计测定光密度进行准确定量的一种分析方法。由于酶是能催化化学反应的特殊蛋白质，能使反应加速，并具有高度专一性。因此，呈色反应不但显示酶的存在，而且高度放大了酶量的变化，可以极为灵敏地反映B 或者F 酶标记抗原或抗体的变化，使EIA 的灵敏度达到或者超过RIA。

化学发光免疫分析（CIA 或者CLIA）是继酶免疫分析法之后发展起来的一种重要的非放射性免疫检测方法。既有化学发光分析的高灵敏性，又有免疫反应的高度特异性，方法简单、快速，是目前在内分泌激素检测领域中占有主导地位的检测方法 ^[1～3]。

本节将从竞争性结合和非竞争结合分析法的角度，扼要介绍RIA、IRMA 及其他放射结合分析的基本原理，其次，以EIA 为重点介绍酶免疫分析方法，最后介绍目前在临床上广泛应用的CIA。

1960 年美国学者Yalow 和英国学者Ekins 分别正式发表了血浆胰岛素RIA 和甲状腺素竞争性蛋白结合分析法（competitive protein binding assay，CPBA）。1970 年，Lefkowite 报道了 ACTH放射受体分析法（radio receptor assay，RRA）。这些方法都是利用过量被测物及其放射性核素标记物相互竞争有限量的特异性抗体（RIA）或者结合蛋白（CPBA 和RRA）的原理测定被测物的含量，操作步骤大同小异；因此，有人将之统称为饱和免疫分析法 ^[4～6]。

Yalow 等人在1960 年正式发表RIA 是激素等物质超微量分析史上的一次革命性突破，曾经极大地推动了内分泌学等生命科学的发展，因而同神经内分泌的创始人Guillemin 和Schally 于1977 年共同获得了诺贝尔生理学或医学奖。现将该方法的理论前提、基本原理和主要操作步骤简要介绍如下 ^[7～9]。

RIA 的理论前提有三点：①放射性核素标记抗原（Ag ^*）和标准或被测Ag（统称非标记Ag）与相应的特异性Ab 有相同的亲和力和结合位点；②Ag ^*和Ab 的量是固定的，而且Ab的总有效结合位点多于Ag ^*的数目。当无Ag 存在时，Ab 只能结合15%～50%的Ag ^*（简称B ₀%）；③Ag ^*、Ag 和Ab 有足够的时间共处于一个反应系统中，使Ag 同Ag ^*相互竞争与Ab 结合的反应最终达到动态平衡 ^[7～9]。

RIA 的基本原理是过量的Ag ^*和Ag 相互竞争同有限量Ab 结合。在未加入Ag时，Ag ^*和有限量Ab 形成的Ag ^*-Ab 复合物的反应遵循质量作用定律，因而反应物Ag ^*和Ab 与产物Ag ^*-Ab 产物保持着动态平衡关系（图1-2-2）。加入非标记Ag 后，Ag 即与Ag ^*相互竞争同Ab 结合，形成的Ag-Ab 和Ag ^*-Ab 产物与反应物Ag ^*、Ag 及Ab 的反应仍然遵循质量作用定律，保持着动态平衡关系。Ag 的加入使Ag ^*-Ab（即B）的形成减少、未结合的Ag ^*（即游离的Ag ^*，简称F）增加。B、F、B/F 或 B/B ₀ 的量与非标记的 Ag 的量存在函数关系，随着 Ag 的增加，B、B/F 或 B/B ₀ 相应减少，而F 则相应增加。因此，当反应达到平衡时，将 B 和 F 分离，测定 B 或 F 的放射性（cpm），除以加入的总放射性得到B%和F%。以B%或B/B ₀%作为纵坐标（Y 轴），以不同剂量的Ag 标准作为横坐标（X 轴），绘制标准曲线（又称剂量反应曲线，图1-2-3），未知样本B 或F 值测得后，即可从此曲线查到被测物的含量 ^[7～9]。

RIA 有四个主要步骤：①竞争性结合反应；②B 和F 的分离；③测放射性；④绘制标准曲线和计算被测物的含量。先设置总计数（T）管、本底计数（包括自然本底和仪器噪音，C）管、非特异性结合（nonspecific binding，NSB）管、零标准即最大结合（B ₀）管、系列梯度的标准（ST）管以及被测样品（B 或Sm）管，再按表1-2-1 中的“+”加样。在4℃或37℃保温足够长时间，令过量Ag 和Ag ^*互相竞争同有限量Ab 结合，当反应达到平衡时即可进行 B/F 的分离 ^[7～9]。

RIA 多数情况下是采取平衡竞争结合系统，即将Ag ^*与Ag 同时加入到反应管中，二者在平衡状态下与抗体竞争结合位点。当灵敏度达不到要求时，可考虑应用非平衡竞争结合系统，即先加入Ag 与Ab 保温，且务必使反应达到平衡，然后再加入Ag ^*，且勿使反应达到平衡（即时间较短的保温）就终止反应，进行 B/F 分离 ^[7～10]。

用第二抗体法（羊抗兔或兔抗鼠）、聚乙二醇（PEG）沉淀法或葡萄糖碳末吸附法分离B 和F，均需离心，较繁琐和费时；而固相化抗体或抗原（即所谓的固相RIA）分离技术则不需离心，具有简单、方便和快速等优点，已广泛应用于RIA、IRMA 及其他非放射性核素标记的免疫分析。将抗体或抗原固定在固相支持物上是免疫固相分析的关键 ^[7～9]。

用选定的方法分离B 和F，并用计数器测T、NSB、B ₀ 和标准被测样品管的cpm 后，即可以标准品的剂量为X 轴，B%、B/F%或B/B ₀%为Y 轴绘制“乙字形”标准曲线（图1-2-3），亦可将B/B ₀%值转换为logit 值，使曲线变为直线。根据被测样品管的B，即可从标准曲线读出被测物的含量（图1-2-3）。近代的计数器均配有电脑软件，按规定的先后顺序放置T、NSB、B ₀ 浓度由低到高的系列梯度标准管及编码的被测样品管，输入操作指令后，即可自动计数并打印出标准曲线及其有关参数和被测样品的含量 ^[7～9]。

竞争性蛋白质结合分析法（CPBA）是利用血浆中天然存在的结合球蛋白作为特异性结合试剂，替代抗体进行激素检测的分析方法。血浆中天然存在的结合球蛋白有甲状腺素结合球蛋白（thyroid binding globulin，TBG）、皮质类固醇结合球蛋白（corticosteroid binding globulin，CBG）和性激素结合球蛋白（sex hormone binding globulin，SHBG），它们分别对甲状腺激素、皮质类固醇激素和性激素有较高的亲和力和结合特异性，均可以替代抗体作为特异性结合试剂，用于甲状腺激素、氢化可的松和睾酮的超微量分析。1973 年，北京协和医院内分泌科利用孕马血清中CBG 建立皮质类固醇激素的CPBA 测定方法。因为马的CBG 与皮质醇的结合最为特异，与皮质酮、可的松和去氢皮质酮的交叉反应仅分别为16%、10%和2%，而与泼尼松、泼尼松龙、地塞米松、黄体酮和17α-羟孕酮等均无明显交叉反应，因此，该方法的特异性明显高于RIA ^[10]。

由于上述RIA 是基于抗原和抗体特异性相结合的原理建立的免疫测定方法，也就是说，凡是能与抗体相结合的分子，不论其有无生物活性或者生物活性高还是低，都能被检测出来。所以，其测定结果反映的是被测定分子的免疫活性而不是生物活性。生物活性物质（统称为配体，L）要发挥其生物学效应首先必须与特异性受体（R）结合，R 具有高度特异性，只能同有生物活性的L 结合。因此，利用被测物与特异性受体相结合的原理建立起来的放射受体分析法（RRA），可以特异性地反应被测物质的生物活性。所以，RRA 的测定结果能准确地反映生物机体的功能状态 ^[11，12]。

放射受体分析（RRA）测定的基本原理是基于过量的被测物（L）和被测物的放射性标记物（ ^*L）相互竞争与有限量的特异性受体（R）结合，同RIA 相似，属于饱和竞争性结合分析法。

有四个主要步骤：①竞争性结合反应；②B 和F 的分离；③测放射性；④绘制标准曲线和计算被测物的含量。

与RIA 测定类似，RRA 测定也需要设置总计数（T）管、总结合管（B ₀）、非特异性结合管（NSB）、标准曲线系列（ST）和被测样品管（Sm）。加样的方法类似表1-2-1。在适合的温度下温育使受体和配体的结合反应达到平衡后，选择适当的方法进行B/F 的分离，通过测定B 的放射活性（cpm）计算特异性结合百分率（B%）。从已经制定的标准曲线上，读出被测样品中配体的含量 ^[11～12]。

与RIA 测定不同，进行RRA 测定所需要的试剂有受体和标记配体。受体主要有全细胞受体、膜受体、可溶性受体和胞内受体。不同的受体制备的方法不同。全细胞受体就是含有特异性受体的单细胞悬液，从被测物作用的靶器官或组织获得单细胞悬液的方法有机械分离和化学分离两种方法。使用全细胞受体制品的优点是配体和受体的结合最接近整体的情况，非特异结合较低。主要缺点包括单细胞血液不易保存，冰浴保存不超过30 分钟；在生理温度下，全细胞中配体和受体的结合会因内化而被降解，使结果解释复杂化；单细胞易凝集成团，从而影响配体与细胞团中间细胞受体的反应。膜受体是指配体的受体在细胞膜上，比如肽类、蛋白质类和儿茶酚胺等配体。将细胞打碎即可分离出含受体的膜碎片。膜受体制品的优点是受体活性较稳定，在-20℃可以保存半年以上，在生理温度下进行配体与受体的结合反应而不存在配体-受体复合物内化降解的问题。其缺点是膜受体和全细胞受体与配体的结合条件可能不同，因此亲和力也可能不一样。可溶性受体通常是将非离子性清洁剂如Triton-X 使细胞或者组织溶解，去除不溶物，收集含可溶性受体的上清液。其优点是同样是不存在用全细胞受体研究时出现的配体-受体复合物内化降解的问题；同时可将受体进行浓缩，适用于从受体水平低的细胞中获得足够数量的受体；便于各种温育调节的控制。主要缺点是用这种受体制品进行RRA 时，非特异性结合可高达25%，原因是受体制品中存在蛋白酶，使配体和受体降解从而影响二者的结合特性。可以加入蛋白酶抑制剂防止此种降解作用。胞内受体指的是甲状腺激素和甾体激素的受体，存在于细胞质和细胞核中，必须将细胞膜和核膜打碎才能分离获得受体。常用的方法是高速超声组织或者打碎机匀浆组织 ^[11～12]。

RIA 的基本原理是根据放射性核素标记抗原和被测抗原相互竞争与有限量抗体的抗原决定簇（以下简称单位点）结合，当结合反应达到平衡时，将游离（F）及与抗体结合（B）的抗原分开，然后测量B 或F 的放射性，并从标准曲线上读出被测抗原的含量。根据上述原理，未达到一定的灵敏度，须限制抗体和标记抗原用量，使测定范围变窄并降低其精密度。根据抗原和抗体之间的反应动力学，过量抗原与有限量的抗体反应需较长时间才能达到平衡（有时要长达72 小时），因而无法及时得出结果。此外，在测定中必须进行B/F 的分离，操作较为烦琐，因此，早在1986 年就有人建议用双位点、非竞争性结合和过量抗体的IRMA 代替RIA。但因IRMA 需用大量经过纯化的抗体，而经典免疫动物法所能得到的抗血清数量有限，以致本法一直未能推广。淋巴细胞杂交瘤技术可由微量不纯抗原或某片段制备大量针对单一抗原决定簇的抗体—单克隆抗体（以下简称单抗），不但解决了IRMA 的抗体供应问题，还可充分发挥IRMA 的优点。从 20 世纪 80 年代起，IRMA 广泛应用于激素、受体、免疫球蛋白、铁蛋白、乙肝表面抗原和肿瘤细胞表面相关抗原等测定。选择一对各自与被测抗原分子上的不同位点（以下简称双位点）结合、彼此完全互不干扰的单抗，其中一种作为固相抗体，非特异性地吸附在聚苯乙烯等塑料载体表面，以便特异性捕捉被测样品中的抗原（Ag）；另一种用放射性核素标记，作为对被测Ag 进行特异性定量的指示剂。将固相抗体（抗体1）、被测样品及标记抗体（ ^*抗体2）同时混合，经5 分钟至2 小时的保温后，洗去未与Ag 结合的多余 ^*抗体2，用γ 计数器测固相载体上抗体1-Ag- ^*抗体2 的放射活性，即可从标准曲线上得知被测Ag的含量（图1-2-4、图1-2-5）。相对于被测抗原，固相抗体和被测抗体均为过量，而且可同时与被测抗原结合。同单位点RIA 相比，双位点或夹心IRMA 具有如下优点：①操作更为简便快捷，可在10 分钟至3 小时出结果；②灵敏度高10 倍；③可测范围大6 倍；④更为特异，可通过不同配对的抗体检测不同分子形式的激素等。但是，甾体激素、小于20 个氨基酸的小肽和其他小分子物质，由于很难获得两个不同结合位点的共同抗体，因此不适用于IRMA 进行测定 ^[13]。

IRMA 可用于：①两种或两组（每组可有多种）不同单抗；②一种（组）为单抗，另一种（组）为常规抗血清；③两种（组）不同常规抗血清（例如：分别为兔和羊抗人促甲状腺素）。其先决条件是：①两种（组）抗体分别与被测抗原分子上不同位点结合，彼此互不干扰；②其中一种（组）必须是高度特异的；③可用 ¹²⁵I 等放射性核素标记；④可牢固地吸附在固相载体表面；⑤数量足够，性质稳定，适用于批量纯化等。此外，为降低非特异性结合和空间位阻，有人主张用 Fab’或 F（ab’） ₂ 代替整分子抗体 ^[13]。

放射免疫（RIA）、免疫反射（IRMA）和放射受体（RRA）等应用放射性核素标记物免疫分析技术的相继问世和推广普及，极大地推动了医学生物学的发展。然而，RIA、IRMA 和RRA 都有其共同的不足之处：①放射性核素对人体有害，需采取防护措施和防止污染环境；②标记抗原或抗体不论是自己制备或购自厂商，其批间差异较大；③常用的 ¹²⁵I 标记物的半衰期短，一般只能使用2 个月；④测量仪器昂贵等。为避免上述弊端，人们一直在研究开发非放射性核素的免疫分析技术。1971 年 Engvall 和 Penlmann 及 Vanweemen和Schuurs 两组学者分别用酶代替放射性同位素制备了酶标记试剂，创立了酶免疫分析技术（EIA）。1975 年问世的杂交瘤技术可大量生产抗不同抗原决定簇的单克隆抗体，大大促进EIA 的发展，明显提高了EIA 的灵敏度和特异性，推动了新一代EIA 的设计。现在EIA 已发展成形式各异、各有其优点和用途的定位、定量、半定量和超微量分析技术。同RIA、IRMA 相比较，EIA 除可避免放射性同位素伤害以外，最重要的优点是酶标记物的有效期长，在无菌或防腐的条件下，4℃或冻干室温下保存期可超过一年。后来在EIA 中引进放大系统，使测定的灵敏度超过RIA，达到10 ^-19mol/L。在医学和生物学中，EIA 的应用越来越广泛，数以千计的EIA 诊断药盒已投放市场，取得了极为显著的社会效益。酶是能催化化学反应的特殊蛋白质，其催化效力超过所有人造催化剂。酶一般可使反应加速10 ⁸～10 ¹⁰ 倍。酶还具有高度专一的特性，每一种酶只能催化一种或一组密切相关的反应。EIA 是将酶催化放大作用和抗原与抗体免疫反应的特异性相结合的一种微量分析技术。酶标记抗体或抗原后，既不影响抗体或抗原的免疫反应的特异性，也不改变酶本身的活性。在EIA 系统中，免疫反应进行以后，使酶催化相应的底物水解呈色，再用肉眼观察有无颜色及颜色的深浅进行定性和半定量分析、用光镜或电子显微镜进行组织和细胞及亚细胞定位或用分光光度计测其光密度进行定量分析。呈色反应显示酶的存在，放大了酶量的变化，反应出某种状态（结合或游离）的酶标抗体或抗原量的变化 ^[14]。

酶免疫分析（EIA）一般根据测定过程中是否需要将结合的酶标记物和游离的酶标记物分离而分为均相和非均相两大类。均相测定中由于免疫反应后有酶活性的改变，所以不需将游离和结合的酶标记物分开。非均相则要求分离游离和结合的酶标记物 ^[14]。

在均相EIA 中有两种主要的生物物理现象：①与一般免疫检测方法相同，抗体（Ab）可识别并同其相应的抗原（Ag）特异性结合；②酶标抗原（Ag ^*）同Ab 结合后形成Ab-Ag ^*可使酶的活性增强或减弱；③Ag 可同Ag ^*互相竞争与有限量的抗体结合。因此，不需对反应系统中的Ab-Ag ^*与Ag ^*进行分离，直接测定酶活性的变化即可推算出被测样品中Ag 的含量。具有上述特点的均相EIA 又派生出多种各具特点的分析模式，包括酶增强免疫分析技术、辅基标记免疫分析法（prothetic group labeling immunoassay，PGLIA）、克隆酶供体免疫分析（cloned enzyme donor immunoassay，CEDIA）、底物标记荧光物质免疫分析法（substrate labeling fluorescent immunoassay，SLFIA）等 ^[15]。

酶增强免疫分析技术（enzyme multiplied immunoassay technique，EMIT）是最广泛应用的均相EIA 系统，属竞争性结合分析法。在EMIT中，酶标记抗原与抗体结合后，酶活性被抑制，游离的酶标记抗原（具有酶活性）增加。所以，反应液中酶活性随着抗原浓度增加而增加，被称之为酶增强免疫分析技术（EMIT）。最常用的酶是葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和溶菌酶。另一种EMIT 是酶活性随着抗原浓度的升高而降低，比如：苹果酸脱氢酶（malic dehydrogenase，MDH）标记甲状腺素（thyroxine，T ₄）后，MDH 的立体结构发生了改变，导致酶活性被抑制。但是，T ₄ 和T ₄ 抗体结合后，可恢复MDH 的酶活性。所以，非标记的待测T ₄ 和MDH 标记的T ₄ 互相竞争，同有限量的T ₄抗体结合，非标记的待测T ₄ 浓度越高，意味着标记T ₄ 与抗体的结合越少，酶活性越低。

均相EIA 由于不需要分离结合和游离的标记抗原，故可以减少因物理分离而引起的误差，其灵敏度为10 ^-9mol/L，主要用于小分子半抗原如药物和小分子激素的测定。它主要缺点是由于没有物理分离结合和游离的标记抗原的步骤，样品中非特异的干扰物质如内源性酶、酶抑制剂及有交叉反应的抗原等容易影响结果。此外，由于均相EIA 采用的是竞争性结合的原理，其测定的灵敏度不如非均相的非竞争性的EIA 高。

非均相EIA 在免疫反应结束后，需要分离游离和结合的酶标记物，然后才能进行测定，可以分为竞争性和非竞争性两大类。

竞争性非均相EIA 包括酶标抗原的EIA 和酶标抗体的EIA。酶标抗原的EIA 的检测原理和操作步骤与经典的RIA 相似，不同的是用酶替代了放射性核素标记抗原，以及将抗体吸附在固相载体上。酶标抗体的EIA 是用酶标记抗体作为示踪剂，使标记和未标记的抗体互相竞争同有限量的固相抗原结合，固相抗原结合酶标抗体的量同被测抗体的浓度成反比。测定固相抗原结合的酶标记抗体酶的活性，可以对被测抗体进行定量。可用于测定多种不同的抗体，也可以检测半抗原和药物。其灵敏度与RIA 相当。

非竞争性非均相EIA，又称为酶联免疫吸附分析法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA），其特点是：①使用过量的试剂，被测抗原（或抗体）同酶标记抗体（或抗原）及固相抗体（或抗原）的结合反应属非竞争性，酶标记物的结合量与被测物的浓度成正比；②均使用固相分离技术（固相抗体或抗原），不但易于分离结合和游离的酶标记物，而且在测定的每一阶段均易于洗涤，减少了各种物质的干扰；③多数ELISA 使用两种抗体，一种固相抗体，一种酶标抗体，被测抗原可同时与两种抗体结合，夹在两种抗体之间，故ELISA 又称为夹心 EIA ^[16]。

定位酶免疫技术是应用酶标记的抗体或抗原作为示踪剂，在组织或者细胞上进行抗原-抗体反应及酶底物的呈色反应，通过显微镜观察，在组织、细胞、亚细胞及分子水平对抗原或抗体进行定位或半定量分析。

在EIA 中由于引进了放大系统，使测定的灵敏度有了较大的提高。最常见的是引进生物素-亲和素放大系统的ELISA 方法。亲和素对生物素有很高的亲和力。一旦结合，则很难解离。生物素-亲和素系统有高度的稳定性。在ELISA 中，使抗体和酶等蛋白质生物素化，即一个蛋白质分子可以结合多个生物素分子。这些生物素化的蛋白质分子一方面保留原来的免疫反应性或酶活性；同时，由于生物素的导入而成为多价，可与多个亲和素分子结合，产生多级放大效应。ELISA 和免疫组织化学中应用生物素-亲和素系统，可明显提高分析的灵敏度。从链霉菌培养滤液提纯的链菌亲和素（streptavidin）与亲和素有相似的生物学特征，也可与生物素结合，显著降低非特异吸附，进一步提高检测的灵敏度。

荧光免疫测定分析技术（FIA）是将荧光素标记在抗体或者蛋白质抗原上作为示踪物，然后按照免疫学原理，与相应的抗原或抗体结合，检测抗原或者抗体的量。荧光免疫分析技术大多使用荧光素标记抗体，也称为荧光抗体技术。常用的荧光素有异硫氰基荧光素（FITC）。该技术的缺点是存在试剂、血清成分、试管等的本底荧光的干扰和激发光源散发光的问题。于是，人们又研发了采用镧系元素螯合物作为示踪物的荧光免疫测定方法，称为时间分辨荧光免疫分析法（TRFIA）。标记物是镧系元素，如铕、钐等。镧系元素螯合物的荧光有两个特点；激发光谱和发射光谱相差大，发射光谱窄，具有长的荧光寿命。这些特点有效地消除了非特异本底荧光的干扰，提高了荧光信号检测的特异性 ^[1～3]。

化学发光是通过化学反应产生的发光现象，通常是由于氧化反应产生的结果。氧化反应使发光物质分子处于激发状态，当这些分子恢复到基态时，以光的形式释放能量，因此测量发射光的强度可以对某种状态的发光物质进行定量。20世纪60 年代即有人以发光物质为示踪剂，利用化学发光测定水样品中细胞的数量，方法灵敏、方便，但特异性较差。1977 年开始将化学发光分析与免疫反应结合起来建立了化学发光免疫分析法（chemical labeling immunoassay，CLIA）。CLIA 既有化学发光分析的高灵敏性，又有免疫反应的高度特异性，方法简单、快速，对某些物质的检出极限可达10 ^-19mol/L。这是继酶免疫分析法以后发展起来的一种重要的非放射性免疫检测方法 ^[1～3]。

发光剂在化学反应（一般为氧化反应）过程中吸收能量，使本身或某些产物分子处于激发状态，当激发分子恢复到基态时以放射光子形式释放能量，这个过程称为化学发光。化学发光不同于荧光，不需要外来光源激发便能发光。CLIA 利用发光剂作为示踪物，在免疫反应以后，标志出某种状态（结合或游离）的免疫反应物的量。发光剂在CLIA 的作用如同RIA 中的放射性核素、FIA 和EIA 中的荧光素和酶的作用一样。由于在CLIA 中产生化学发光需要发光剂和催化氧化反应的酶，所以CLIA 有两类标记的结合物。一类是把化学发光剂标记在抗原或抗体上，免疫反应完成后，加入氧化剂和催化剂（包括氧化酶、H ₂O ₂等），产生化学发光，进行终点测量。另一类是将催化氧化反应的酶标记在抗原或抗体上，免疫反应后，加入发光剂和H ₂O ₂，产生化学发光，进行终点测量。这类CLIA 的实质是酶免疫分析法与化学发光的结合，用化学发光剂代替常规的酶底物，所以又称酶免疫化学发光分析法。常用的氧化酶有辣根过氧化物酶（HRP）和葡萄糖氧化酶及碱性磷酸酶等 ^[1～3]。

常用的化学发光剂有鲁米诺及其衍生物、吖啶酯和草酸酯等，可标记在抗原或抗体上。CLIA的基础是免疫反应，其测定程序与EIA 相似，不同的只是标记物和最后的定量方法。CLIA 的测定体系像EIA 一样可分为均相和非均相两大类。非均相CLA 又可分为液相和固相两大亚类，固相的CLIA 又有竞争和非竞争、夹心和不夹心等多种形式。

抗原根据有无免疫原性，可分为完全抗原和半抗原两大类。具有免疫原性（抗原性）、可诱发机体特异性免疫应答产生抗体和免疫反应性（反应原性），即能同抗体特异性结合的物质，成为完全抗原。分子量大于2000 道尔顿（D）的物质，如：促甲状腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）、HGH、激素受体、甲状腺过氧化物酶以及激素或者受体的自身抗体等均属完全抗原。分子量小于2 000D 的物质，如：睾酮、甲状腺激素和cAMP 等具有免疫反应性，可以同相应的抗体特异性结合，但不具备免疫原性。必须与大分物质如牛血清白蛋白等载体结合后，才能诱发机体产生抗体，称为半抗原。有些分子量大于2 000D、免疫原性较弱的多肽或激素，比如胰岛素（分子量5180D）等生物活性物质，也必须与大分子载体连接或者吸附在碳末、乳胶、赖氨酸、羧甲基纤维素或聚甲基丙烯酸甲酯等吸附或者聚合剂上，才能通过提高其免疫原性而得到高质量的抗体。

抗原的特异性是由抗原分子表面的抗原决定簇（结合位点、表位）决定的。这些决定簇实质上是特殊的化学基团，能够通过其空间构型与相应的抗体或淋巴细胞表面的抗原受体特异性结合，这种结合类似于钥匙和锁的匹配。完全抗原的表面有许多抗原决定簇，可分别与不同的抗体或抗原受体结合腔（锁）结合 ^[1～6]。

在抗原诱导下于B 淋巴细胞内合成后分泌到体液中，能与相应的抗原特异性结合并具有激活补体等生物功能的免疫球蛋白（Ig）称为抗体，但并不是所有的Ig 都是抗体。

抗体根据重链（H）恒定区（C）分子结构的不同可以分为IgG、IgA、IgM、IgD 和IgE。按照与抗原结合后能否出现可见反应，分为完全抗体和不完全抗体。前者包括血清学诊断中常用的凝集素抗体和沉淀素抗体等，后者包括阻抑抗体。阻抑抗体能与抗原结合而不出现可见反应，但能阻止抗原再与完全抗体结合。IgM 为完全抗体，IgG为不完全抗体。按获得方式不同，抗体可分为：①天然抗体（自然获得）；②获得性抗体（经感染、预防接种或者用胰岛素等蛋白质激素治疗产生的抗体）；③自身抗体（在病理情况下，针对自身组织、血液成分等产生的抗体，比如甲状腺过氧化物酶抗体等）；④制备抗体（包括单克隆抗体和多克隆）和基因工程抗体。在进行免疫分析时，不论是用单克隆抗体、多克隆抗体还是基因工程产生的抗体都需要对其特异性、亲和性、滴度和稳定性进行鉴定 ^[1～6]。

为了检测及放大抗原和抗体、配体与结合球蛋白或者受体之间的反应结果，绝大多数免疫分析、CPBA 或RRA 均需用放射性同位素、酶、荧光素或者化学发光剂作为标记物标记抗原、配体或抗体。标记的抗原、配体或者抗体统称为标记化合物，酶标记的抗原或者抗体又称为酶结合物。标记化合物的质量即比活性、免疫反应性（或生物活性）和稳定性同免疫分析、CPBA 和RRA 的灵敏度和重复性等有很大关系。因此，每一批新的或者保存一段时间以后的标记化合物均需进行质量鉴定，合格后方可继续使用。抗原、配体或者抗体的纯度越高，标记的效果就越好。制备的抗体均需经过亲和层析提纯后才能用于制备标记化合物。 ³H 和 ¹²⁵I 是最常用的放射性核素标记物，用于RIA、CPBA、RRA 和IRMA 等免疫测定。由于氢是多种化合物的组成成分，所以 ³H 不明显改变被标记物的分子结构和生物活性。 ³H 半衰期13 年，放射活性保留时间长。但是，一般实验室不能制备 ³H 标记的化合物，而且其比放射性低。所以 ³H 一般只用于小分子和甾体类化合物的标记。 ¹²⁵I 半衰期60 天。标记方法简单，大多数实验室可以自己标记，而且比放射性高，因此是常用的放射性核素。酶结合物是EIA 的关键试剂，最常用的酶有辣根过氧化物酶（HRP）、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶、β-D-半乳糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶等 ^[1～6]。

化学结构及结合特性与被测物相同、用于配制标准试剂制作剂量反应（标准）曲线，以用于待测样品中被测物质的定性、半定量和定量的物质称为标准品，其纯度应在95%以上。作为本实验的标准品必须用国家标准或者国际标准核查和比较，证明为同质性并确定其含量，方可应用于临床检测。理论上，标准品和被测物要在完全相同的条件下进行反应。比如测定人血清中某激素的水平，标准品最好用不含该激素的人血清将标准品按倍比梯度稀释5～8 个不同的标准浓度。但是由于人血清难以获得，而且价格昂贵，不易去除被测物质。含蛋白质的缓冲体系如牛血清白蛋白（BSA），在证实其稀释效果和去激素的人血清无明显差异后，也可以作为标准品的稀释液。此外，如果激素存在明显的种属差异，也可以用其他种属的血清替代人血清去做标准品稀释。一般标准品中需要加防腐剂。类固醇或者甲状腺素标准品可在4℃保存，而多肽类或蛋白质激素的标准则适宜在-20℃或-40℃冻存，并切忌反复冻融。标准品的计量单位应采用国家剂量单位表示，例如：摩尔每升（mol/L）、毫摩尔每升（mmol/L）。对有国际标准品的品种，一般采用国际单位IU/L 或者mIU/L 等表示 ^[1～6]。

内分泌激素的测定，无论是采用抗原抗体相结合原理的免疫分析技术还是色谱和质谱技术，都有其优点和缺点。检测人员、研究人员或临床医生充分了解有关的测定原理和注意事项，才能更确切地解释某项测定结果的临床意义，有时还可从“反常”结果得到启迪，发现新的规律或现象 ^[1～6]。

基于抗原抗体相结合原理的免疫分析技术，包括 RIA、CPBA、IRMA、EIA、FIA 和 CIA 的方法学判断指标大同小异，兹综述介绍如下。

制作标准曲线和测定样品所用的试管、96 孔塑料板条等样品容器，在不加任何试剂时（即空白管或孔）的cpm 或OD 值，称为本底、自然本底或噪音（noise，N），是测量仪器（计数器、酶标仪或化学发光仪等）性能和测定管、孔等制品质量优劣的客观指标之一，应选用本底低的测量仪器和样品容器 ^[1～6]。

不是由抗原与抗体或配体（即被测物）与其相应的结合蛋白（如受体或CBG）特异性反应而形成的本底结合率，统称为非特异性结合率（nonspecific binding percent，NSB%）。原理不同，例如：竞争和非竞争；以及原理相同但测定方法有异，例如：液相RIA 和固相RIA，NSB 管或孔的加样内容差别甚大。液相RIA 标记和非标记抗原及抗体均在溶液中，NSB 管或孔只需加缓冲液和标记抗原即可；而固相RIA 因抗体已包被在管或孔表面，NSB 管除加缓冲液和标记抗原外，尚需加入非标记抗原。IRMA 和ELISA 等过量抗体夹心免疫分析法则加缓冲液和标记抗体。不论何种分析法，其 NSB 均不得大于 10% ^[1～6]。

即含特异性结合蛋白（抗体、抗原、结合球蛋白或受体）、标记化合物和缓冲液反应管或孔在不加标准品时的最大特异性结合率即B ₀/T%（简称B ₀），可根据所要求的灵敏度和测定范围，在25%～65%之间选定。B ₀ 一旦确定，批间的波动不得大于 5% ^[1～6]。

即能与零剂量区别的被测物（标准品）的最小可测值。一般是通过测定10 批以上的B ₀，求出其均值（ ）和标准差（SD）后，用 ± 2SD 从剂量反应（标准）曲线上读出的相应值剂量即为某种测定的灵敏度。灵敏度应根据被测物在生理和病理等情况下的含量及所需测定范围而定。例如：正常人、艾迪生病和皮质醇增多症血浆总皮质醇的含量均为纳克（ng）水平。不必要求皮克（pg）灵敏度。再如正常人、Graves 病、住院和甲状腺功能减退患者，血清TSH 的水平为＜ 0.001mIU/L到＞ 1 000mIU/L，相差百万倍。但从临床诊断的角度考虑，正常人TSH 血清的含量为0.25～4.2mIU/L，4.3～10mIU/L 可诊断为亚临床甲状腺功能减退，＞ 10mIU/L 可诊断为临床甲状腺功能减退，＜ 0.05mIU/L 有助于 Graves 病的确诊，因此，高灵敏度比可测范围大更有意义，应设法提高其测定的灵敏度。一般而言，CIA 最为灵敏，其次是FIA、IRMA 和放大ELISA，而RIA 则不能用于Graves 病的诊断。非竞争性结合原理的测定方法，其灵敏度高于竞争性结合法。在竞争性结合法中，B ₀ 为30%左右的测定灵敏度高于B ₀ 在50%左右的测定灵敏度 ^[1～6]。

其评价指标是交叉反应率，一般用被测物和类似物B ₀ 降低50%所需物质浓度的比值表示。例如：用RIA 测血浆睾酮，为使B ₀ 降低50%需用5ng的睾酮，而其类似物去氢表雄酮硫酸酯（DHEA-S）则需用500ng。因此，睾酮RA 同DHEA-S 的交叉反应率为5/500 × 100% = 1%。正常成年男性睾酮和DHEA-S 的含量分别为310ng/ml 和200～3 350ng/ml，即DHEA-S 的浓度比睾酮高67～335倍。虽然睾酮RIA 同DHEA-S 的交叉反应只有1%，但却有高达2～33ng/ml 的DHEA-S 被误认为是睾酮，特异性差，无实际应用的价值。反之，血清总T ₄ 的RA 同T ₃ 的交叉反应虽然高达5%，但成人正常值前者（50～160nmol/L）比后者（1 ～3nmol/L）高50 倍以上，因此，同T ₃ 的交叉反应不会明显影响总 T ₄ 的测定结果 ^[1～6]。

以不同剂量公认标准品的回收率表示，加入的剂量与实测值不能高于或低于10%，即回收率在90%～110%范围内的测定方法才可认为是准确的。

反映批内和批间测定的重复性，用变异系数百分率（CV%）表示。其计算公式为：CV% =（SD/重复测定的均值即x）× 100%。批内和批间重复的CV%应分别小于10%和15% ^[1～6]。

又称平行性，是判断被测物与标准品是否为同一物质的客观指标。可用被测物含量高的患者血清，例如：生长激素（hGH）含量高的肢端肥大症患者血清进行5～8 个连续稀释，在与制作标准曲线相同的条件下进行测定，如患者血清稀释曲线与hGH 标准曲线平行，即可认为被测物是hGH ^[1～6]。

又称可测范围。可选用10 次以上重复测定的精密度图中CV%小于15 的标准品最小和最大剂量作为工作范围。一般而言，可测范围应在正常人最低值之半和两倍最高值之间才能满足临床的最低要求。例如：正常成人血清TSH 的含量为0.25～4.2mIU/L 之间，其工作范围至少应在0.125～8.400mIU/L 之间。被测物含量太低的样品应萃取和浓缩，太高的则需加以稀释 ^[1～6]。

用于监测批间测定的重复性。多数被测标本为血清，需用血清配制含有高（ED75）、中（ED50）、低（ED25）三个待测物有效剂量供监测批间测定的重复性，因此质量控制样品又简称为质控血清。有效剂量即ED25、ED50、ED75 分别为B ₀%改变25%、50%、75%所需的被测物剂量。一般而言，同其标示值相比，三个质控血清有一个超过3SD，两个超过2SD 或三个均超过1SD 的，其测定的重复性差，结果不能用，必须究其原因。对于不同批的测定，如 ED50 的 CV% ＞ 15 的，其测定结果也不可靠 ^[1～6]。

激素、受体及其自身抗体的定性、半定量和定量分析，不但是预测、早期诊断内分泌病并追查疗效和评价预后的客观依据，也是研究内分泌疾病发病机制、早期预防或延缓其发病的重要指标。但激素的合成、分泌、运输、代谢和作用过程复杂，受体结构异常的位点多样，激素和受体自身抗体的形成受多种因素的影响。因此，不论是研究人员或临床医师，除了理解本章介绍的分析方法所依据的原理和分析模式外，尚须重视如下注意事项，方能对某项测定结果作出科学的判断 ^[1～3]。

指某种激素以不同的分子形式存在于组织或血清中，其生物活性因分子形式的不同而异。例如：①hGH 在腺垂体就有单体（human growth hormone，hGH）和二聚体（hGH·hGH）两种分子形式，分泌到血循环后，不但有hGH 单体、二聚体，还有多聚体以及与其特异性结合蛋白结合的复合物，其中，只有hGH 单体有生物活性；②血清中存在胰岛素、变构胰岛素（胰岛素B 链C 末端25 位的苯丙氨酸被亮氨酸取代）及胰岛素的前体——胰岛素原、32～33 位和65～66 位断裂的胰岛素原等，其中，胰岛素的生物活性最强，变构胰岛素大为减弱，而胰岛素原的生物活性只有胰岛素的7%；③由84 个氨基酸组成的甲状旁腺素（PTH）在肝及肾中裂解为1～33 及34～84 两种片段，整分子PTH 及1～33 片段有生物活性，而34～84 片段则无生物活性；④TSH 的生物活性位于整分子TSH 的β 亚基，但游离TSH～β 亚基的生物活性只有整分子 TSH 的 1/50 ^[1～3]。

属另一种类型的激素不均一性。皮质类固醇、性激素及甲状腺激素等，由于血清中存在相应的结合蛋白，即皮质醇结合球蛋白（cortisol binding globulin，CBG）、性激素结合球蛋白（sex hormone binding globulin，SHBG）及甲状腺激素结合球蛋白（thyroid hormone binding globulin，TBG）等，因此，在血清中是以游离和结合两种形式共存的，其中，有生物活性的游离型只占1%以下。妊娠、雌激素及甾体口服避孕药可使结合球蛋白增加，肝功能受损则减少其合成，因而无生物活性的结合型激素可相应明显升高或降低，但有生物活性的游离型激素则无明显改变 ^[1～3]。

一般而言，有生物活性的激素都具有免疫反应性，但有免疫反应性的激素不一定都有生物活性。例如：用抗胰岛素的多克隆抗血清进行RIA，虽然胰岛素和胰岛素原的生物活性差别很大，但都能同RIA 所用的多克隆抗体结合，因此，称为免疫反应性胰岛素（immunoreactive insulin，IRI）。用胰岛素受体进行RRA，由于胰岛素原很难同胰岛素受体结合，因此，测定结果反映的是生物活性胰岛素的水平。选用位点特异、同胰岛素原无交叉的单克隆抗体进行免疫分析，例如：北京协和医院内分泌科报道的生物素（biotin，B）-亲和素（avidin，A）放大ELISA，同胰岛素原未见有交叉反应，可特异性检测有生物活性胰岛素的水平，称为血清真胰岛素 BA-ELISA ^[1～3]。

甲状腺激素和类固醇激素等非肽类激素的结构本身无种属差异，但各种糖皮质激素的相对比例则可因种属的不同而异。例如：人的糖皮质激素以皮质醇为主，而啮齿类动物则以皮质酮为主。多肽类激素有程度不同的种属差异，例如：胰岛素的种属差异较小，人和狗胰岛素的一级结构一样，只有一个氨基酸不同于猪和兔胰岛素，3 个氨基酸不同于牛胰岛素，与鼠胰岛素也只有5 个氨基酸的差别。因此，用多克隆抗血清作为抗体的来源，IRI 的RIA 可用于不同种属胰岛素的测定。但胰岛素原C 肽差异较大，因此，人胰岛素原C肽RIA 不能确切反映其他种属动物的胰岛素原C肽水平 ^[1～3]。

自身免疫性内分泌疾病的易感性及受体抵抗的发病率有人种差异，但激素和受体的结构无明显种属差别。TSH 和甲状腺激素的正常值无明显的人种、地区、性别和年龄的差别，但其他的激素特别是促性腺激素和性激素则有明显的性别和年龄等的差别 ^[1～3]。

抗激素、受体及内分泌组织自身抗体的发生率很高，例如：高达10.3%的女性和2.75%的男性血清中存在抗甲状腺、T ₃ 和T ₄ 的自身抗体，虽然多数属无症状的自身免疫反应，但自身抗体的存在可能使测定的结果偏高或偏低。导致内分泌自身免疫性疾病的自身抗体，因其特性差别较大，有的可干扰激素的测定，有的则不影响激素的测定结果。据文献报道，具有GH 生物活性的GH 或GH 受体的自身抗体可导致肢端肥大症（肢大）。有的自身抗体可同 ¹²⁵I～GH 互相竞争同RIA 抗体结合，所反映的是血浆中存在高浓度的自身抗体而不是真正GH 的水平。因此，这类患者治疗后RIA 的“免疫反应性（immunoreactive，IR）GH 水平高”，不能认为治疗无效。例如：患者A，男，18 岁，经两次手术和两次放疗后，IR-GH和 IGF-1 仍然很高（分别为 60μg/L 和 28 000U/L）、肢大的临床表现未减轻，实验室研究结果表明，血清中存在具有GH 生物活性、可同 ¹²⁵I-GH 竞争与RIA 用的抗体结合的IgG 自身抗体。反之，有的自身抗体并不影响IR-GH 测定，用RIA 测出GH水平正常，不能除外肢大。例如：患者B，女，53 岁，IR-GH 基础值正常，但IGF-1 高达9 500U/L（正常范围450～2 200U/L），临床上有典型的肢大表现。实验室研究结果表明，患者血中存在具有GH 生物活性（促进脂肪生成等）、但不能同 ¹²⁵I-GH 竞争与RIA 用的抗体结合的 IgG 自身抗体 ^[1～3]。

不同种属间存在的共同抗原称为异嗜性抗原（heterophilic antigen），其相应的抗体即为异嗜性抗体。据报道，在正常人群约有1%以上的血清中存在抗牛血清白蛋白和抗小鼠的抗体。因此，如果患者接受了包含小鼠免疫球蛋白的免疫治疗或造影试剂，或者暴露于来自家养宠物或食物污染物中的异体抗原，或者经常接触动物或者动物血清等，体内会产生异嗜性抗体。这些抗体有时候作为桥接抗体，将免疫测定分析的捕获抗体和信号抗体桥接起来，并产生假性高值；有时候这些抗体也可能结合到捕获抗体或者信号抗体上，从空间上阻断了与特异抗原的结合，而产生假性低的测量值。这些抗体对干扰的测定，在分析结果时应加以考虑 ^[17]。

此外，饮食成分、药物、季节和昼夜节律、月经周期和妊娠以及标本的采集和保存等，都可能影响测定结果。研究人员和临床医师如能高度重视，不但可避免错误的解释，还可能从中发现新的规律和现象，提高内分泌的研究和诊断水平。

液相色谱串联质谱技术（LC-MS/MS）是利用色谱的分离技术和质谱的特异性检测技术，确定物质组成及含量的重要技术。作为临床检验领域的新兴技术，具有测定特异性强、灵敏度高，可同时测定多种化合物，并且可弥补目前常规生化免疫方法无法测定的项目，在国外已有较为成熟的应用，其主要组成包括两大块，一部分是液相色谱系统，另一部分是质谱系统 ^[18～21]。

色谱分离技术是根据待测物中各物质在固定相和流动相间分配系数的差别，对混合物进行分离的物理化学方法。按流动相和固定相的物理状态，色谱系统可分为气相色谱法、液相色谱法和超临界流体色谱法。目前临床检验领域与质谱联合最为常用的是液相色谱系统。液相色谱系统以液体为流动相，根据其对压力承受能力的不同又分为高压液相色谱以及超高压液相色谱。液相色谱仪主要分为高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统和数据处理系统。色谱柱是分离系统的核心部件，也是实现待测物分离的最主要部分，进行色谱分离要考虑色谱柱的填料类型、柱内径、柱长度，这些是影响色谱分离效果的主要成分。此外，液相色谱系统的检测器可以是紫外吸收检测器，也可以是荧光检测器、电化学检测器等。而在LC-MS/MS 系统中不包含上述检测器，LC-MS/MS 系统的检测器在质谱系统部分 ^[18～21]。

质谱检测技术是一种测量带电粒子质荷比的分析技术。质谱仪主要包括离子源、质量分析器、检测器和真空系统，根据不同的电离形式离子源又分为电子电离源、化学电离源、电喷雾电离源、大气压化学电离源、大气压光致电离、快原子轰击电离源、基质辅助激光解析电离源以及电感耦合等离子体。质量分析器是质谱仪组成的核心部件，其作用是将带电离子根据其质荷比大小加以分离，以区分各种离子的质量数和丰度。目前用到的质量分析器有四极杆质量分析器、飞行时间质量分析器、离子阱质量分析器、离子回旋共振质量分析器、静电场轨道质量分析器、电磁扇形质量分析器等 ^[18～21]。

不同的质谱仪类型均有其应用上的优缺点以及适用的研究领域，在临床实验室常规检测中，最常使用的是基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOF）、电喷雾电离源或大气压化学电离源电离的三重四极杆质谱仪或离子阱质谱仪（MS/MS），以及电感耦合等离子体质谱仪（ICPMS）。MALDI-TOF 主要用于微生物鉴定以及组学分析中，ICP-MS 则主要用于无机元素的测定，MS/MS 常与液相色谱系统联合（LC-MS/MS）用于需进行准确定量的项目如激素、氨基酸等定量检测 ^[18～21]。

LC-MS/MS 是当代最重要的定性和定量技术之一，其结合了液相色谱的高分离能力和质谱的高灵敏度和高特异性特点，相比传统的免疫学技术及单纯的色谱技术，在特异性、灵敏度及多组分同时检测上具有明显的优势。LC-MS/MS 可应用于复杂基质中多种化合物的分析测定，在遗传代谢病、类固醇激素、营养元素、蛋白质多肽、治疗药物检测方面有不可替代的作用 ^[18～21]。

1990 年美国杜克大学Millington 教授等首次将串联质谱技术应用于新生儿遗传代谢病筛查，该技术能够在2～3 分钟内对一个样本同时检测几十种化合物，通过对检测数据的组合分析，实现了一次实验检测多种疾病的目的，提高了检测效率，主要针对氨基酸代谢病、有机酸血症、脂肪酸氧化代谢障碍三大类疾病，包括苯丙酮尿症、半乳糖血症、先天性肾上腺皮质增生症、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症、同型半胱氨酸尿症等。质谱技术在遗传代谢病筛查方面具有检测通量高、检测准确性高、使用干血片作为检材方便运输保存，目前国内外已广泛采用串联质谱技术进行新生儿遗传代谢病的筛查 ^[20～21]。

尽管目前免疫方法已可对甲状腺激素、性激素等进行常规检测，但是激素的检测目前在临床领域仍然面临巨大的挑战，一方面许多激素具有相似的化学结构，免疫方法所使用的抗原抗体原理可能会导致交叉干扰，在体内存在的一些异嗜性抗体也会对免疫学方法的检测结果造成干扰；另一方面，大多数激素的浓度很低，有结合及游离形式，因此对方法的灵敏度要求较高，比如游离睾酮、雌二醇等在男性和女性中含量差异很大，需要有较高的灵敏度和较宽的线性范围才能满足临床检测需求。此外，对于某些复杂的疾病，由于代谢通路障碍，影响该通路上多种激素，需同时进行多个激素的检测，比如对先天性肾上腺皮质增生症的诊断，可能需要同时测定17 羟孕酮、11 脱氧皮质醇、雄烯二酮、18 羟孕酮等一系列激素，才能够对具体类型准确区分，然而免疫学方法仅能够测定有限的激素。目前的LC-MS/MS 技术通过质荷比对各激素进行监测联合色谱的有效分离，特异性很高，可以避免结构相似物以及异嗜性抗体的干扰，多种激素，如 T ₃、T ₄、FT ₃、FT ₄、雌二醇、睾酮等的参考方法均为LC-MS/MS 方法，并且其灵敏度高，可以对女性中的痕量睾酮进行准确检测，以及对男性或者绝经后女性雌二醇的测定。此外，LC-MS/MS 可以一次同时测定十几种类固醇激素，高通量实现对先天性肾上腺皮质增生症代谢障碍的鉴别诊断，而目前的嗜铬细胞瘤及副神经节瘤的诊断及鉴别诊断推荐采用测定血或尿中3-甲氧基肾上腺素和3-甲氧基去甲肾上腺素，LC-MS/MS 是目前推荐的测定方法。总之，LC-MS/MS 技术因其特异性、灵敏性、高通量等因素在内分泌领域正发挥着越来越重要的作用 ^[22～23]。

包括维生素、氨基酸及脂肪酸在内的营养元素测定对预防及诊断相关疾病具有重要作用，LC-MS/MS 技术在上述项目的检测中也具有广泛的应用。LC-MS/MS 可用于脂溶性维生素A、D、E 以及水溶性维生素 B ₁、B ₂、B ₆、B ₉、B ₁₂ 等的测定。且其在25 羟基维生素D（25-hydroxyvitamin D，25-OH-D）的测定中比免疫方法优势巨大，免疫方法测定25-OH-D 常会受到3-epi 差向异构体以及类似物的干扰，且不能够区分测定25-OH-D ₂和25-OH-D ₃ 这两种在体内都可能存在的维生素D 形式，而LC-MS/MS 方法由于其特异性高，可区分测定 25-OH-D ₂ 和 25-OH-D ₃，不受 3-epi 异构体影响等优点被广泛应用于临床检测。此外，LC-MS/MS 可用于含量极低的维生素D 活性产物1，25 二羟维生素 D（1，25-dihydroxyvitamin D，1，25-（OH） ₂-D）的检测，也可以用于对维生素D 其他代谢物如24，25 二羟维生素D（24，25-dihydroxy vitamin D，24，25-（OH） ₂-D）的检测。检测24，25-（OH） ₂-D 及其与25-OH-D 的比例可用于筛查因CYP24A1 突变导致的特发性高钙血症。北京协和医院检验科在2018 年建立并发表了LC-MS/MS 检测24，25-（OH） ₂-D 的方法。LC-MS/MS 技术可以同时准确定量数十种氨基酸和脂肪酸，为此类项目相关的临床研究提供了可靠的方法 ^[24～29]。

蛋白质定性分析中MALDI-TOF 具有巨大优势，但是其定量分析中LC-MS/MS 则更胜一筹，目前LC-MS/MS 已被用于PSA、甲状腺球蛋白、PTH、胰岛素、HbA1c、α-淀粉样肽、Tau 蛋白等多肽或蛋白质的准确定量分析，为传统的免疫学测定方法提供了更为准确特异的选择 ^[20～21]。

LC-MS/MS 可以在单次运行中同时定量分析多个化合物，对于一些联合给药如免疫抑制剂、抗病毒药物等，LC-MS/MS 技术具有很大吸引力。目前LC-MS/MS 在治疗药物监测中几乎囊括了所有的药物如免疫抑制剂、抗病毒药物、抗癫痫药物、抗抑郁药物、抗生素、抗肿瘤药物、抗心律失常药物以及非法滥用药物等 ^[20～22]。

LC-MS/MS 在临床应用中具有特异性高、灵敏度好、通量高，可同时测定几十种待测物 ^[20～22]，并且可测定部分目前生化免疫学方法无法测定的项目，因此具有广阔的应用前景。但是目前的LC-MS/MS 应用还具有很多局限性：①方法不一致，目前的方法多是自建方法，各个实验室间方法有较大差异；②配套试剂不成熟，多数试剂还停留在实验室自配试剂自建方法的基础上，不利于实验室间结果的一致化；③手工操作较多，尽管已有部分能够进行自动化前处理的系统对样本进行前处理，但是手工操作仍然较多；④仪器较为昂贵，目前多数仪器为进口仪器，价格昂贵；⑤人才缺乏，质谱方法的建立需要的专业技能较高，对操作人员要求高，而目前经过专业系统化培训的人才较少；⑥智能化发展不足，目前LC-MS/MS 结果尚无法直接与实验室信息系统（laboratory information system，LIS）传输结果，只能通过文本或者办公软件联合代码进行传输，易出现错误。

尽管LC-MS/MS 技术在临床检验领域具有很多优势，但是在其临床结果解读中有诸多需要注意的事项。在结果定量中，需要培训相对专业的人员来判读哪些是目标峰，哪些是干扰峰，对错误的峰的积分会造成错误结果的报告；需要有熟悉待测物与临床疾病结果间关系的检验专家对结果进行解读，对可能错误的结果及时判别。另外，对于新生儿筛查中一次提供几十种上百种检测物需要有专业人士提供综合的结果分析。

无法否认的是LC-MS/MS 技术在临床检测领域已经展现出强大的优势，凭借其特异性好、灵敏度高、通量高，可检测部分目前临床常规方法无法检测的化合物等特点，其必将在临床检验领域占据一席之地，与现有生化免疫技术长短互补。然而，其还存在着自动化程度低、仪器昂贵，配套试剂不成熟等阻碍其广泛应用的不足之处，但是随着国内外医疗器械生产厂商以及医疗应用机构的广泛重视，目前存在的缺点正在慢慢被解决，未来LC-MS/MS 技术无疑会有更为广阔的应用空间。

人体生理过程的稳态依赖于多种细胞和器官作用的协调作用，这是来自神经及激素两种调节系统作用的紧密配合，神经调节与激素调节的特点是生物在长期适应环境的过程中发生与发展起来的，它们互相补充、协调一致、保持稳态。激素的分泌的特点有：①具有生物节律；②下丘脑、垂体及靶腺之间存在着相互依赖，相互制约的反馈性调节作用；③激素之间还存在着协同和拮抗等相互作用；④激素广泛地控制着机体各组织的代谢，反之激素的分泌也受代谢物质的反馈调节；⑤自然界环境的变化对激素的分泌也有影响。因此在解读激素结果时，往往不能只根据单一激素的数值得出诊断结论，而需要结合上下游激素的改变和外界因素做出判断激素改变是原发性还是继发性，是生理性还是病理性，是否为应激影响等 ^[1]。

此外，目前临床内分泌激素检验常用的多种较敏感的免疫方法如化学发光法、酶联免疫吸附法和放射免疫法等，都存在局限性。特别是激素的免疫活性可能不一定与生物活性相对应，并且可能存在假阳性和假阴性结果。在某些情况下，如患者的血液如含有异嗜性抗体，这些抗体与化验中使用的动物源性抗体相互作用，会产生不正常的低值或高值。当内分泌激素检测结果与临床表现有差异时，临床医生必须通过其他方法验证结果的准确性，要与相关实验室的专业检测人员保持密切沟通，可能需要使用另一种试剂盒、另一种免疫方法来测量样品，或者用免疫法以外的方法测量激素。精确测定激素的技术包括高压液相色谱和目前以测定类固醇激素为优势的LCMS/MS 检测法。

多种激素分泌入血后，会与激素结合蛋白结合，因此测定的激素分为总激素（与激素结合蛋白结合部分）和游离激素。测定游离激素更能反映生物活性的部分，但存在含量低，检测不稳定的缺点。而总激素因为在血循环中含量高且半衰期长，更为稳定故应用也很广泛。如与CBG 结合的总皮质醇和与SHBG 结合的总睾酮，测定数值可受结合蛋白水平的变化的影响。在怀孕或服用口服避孕药的妇女中，高雌激素水平可能导致CBG升高，会高估皮质醇，造成高皮质醇血症的假象。在患有糖尿病或其他胰岛素抵抗状态，可能降低SHBG 水平的人群中，较低的总睾酮水平可能会提示雄激素缺乏的假象。相反，甲状腺功能亢进或雌激素过量可导致SHBG 升高，导致总睾酮水平升高。

激素分泌可以是连续的或间歇性的，也存在分泌的节律。

甲状腺激素为持续分泌，T ₄的半衰期为7～10 天，T ₃ 的半衰期为6～10 小时，而白天、月和年的水平变化不大。

促性腺激素、黄体生成激素（luteinizing hormone，LH）和卵泡刺激激素（folliclestimulating hormone，FSH）的分泌呈现脉冲式。根据月经周期的不同阶段每隔1～2 小时释放一次脉冲。生长激素（growth hormone，GH）也以脉冲方式分泌，在脉冲之间检测水平较低。因此，单次测量对诊断GH 缺乏或过多没有过多帮助。

激素分泌的节律有按天评价的昼夜节律，最典型的代表是垂体-肾上腺轴激素的昼夜节律，24 小时内测得的血浆皮质醇水平在清晨最高，在夜间最低。此外，皮质醇释放是脉冲的，受垂体ACTH 分泌的脉冲调控。GH 和催乳素的分泌在睡眠期间增加，尤其是快速眼动期。也有按月评价的节律，如月经周期是一个更长更复杂（28 天）的生物节律，女性垂体-卵巢轴激素如LH/FSH、雌激素和黄体酮随月经周期的变化而变化，因此判断育龄期女性激素是否正常需要明确抽血时间在月经周期的第几日。

情绪压力、低血糖状态、急性疾病和重症疾病均可使ACTH 和皮质醇、GH、催乳素、儿茶酚胺迅速增加，升高可以在几秒钟或几分钟内发生。这也是低血糖兴奋试验的原理之一。

许多激素调节身体对能量摄取和消耗，因此激素分泌也会受进食和禁食的影响。如进食后胰岛素分泌增加，睾酮、生长激素减少；而长期禁食如神经性厌食可引起多种激素的分泌发生变化，如皮质醇、生长激素等水平增加，而性腺功能提示低促性腺激素性性腺功能减退，甲状腺功能提示低T ₃ 综合征。

多种激素在婴儿期、青春期、成年期、老年期的正常范围是不相同的，因此如类胰岛素样生长因子 1（insulin like growth factor 1，IGF-1）、脱氢表雄酮、性腺轴激素的正常范围是依据年龄而给予的。

如肾素、醛固酮可能随钠摄入量、体位和年龄而变化。对于这些激素，所有相关的细节必须提前规范，否则可能无法解释结果 ^[4]。

在基线状态如果仅凭一次随机激素测定，往往很难判断出是否异常，用激素的基线状态来评估内分泌功能时，有以下三方面的限制：①有些激素如ACTH 易波动、ADH 含量极低而在外周血的测定较为困难、PTH 在血中有多种形式存在等均会干扰最终的结果判断；②促激素的分泌调节很复杂，如饥饿、营养不良、神经性厌食及剧烈运动均可抑制促性腺激素分泌，而致不排卵。高皮质醇血症可抑制促性腺激素分泌导致女性月经稀发或闭经，男性性腺功能减退；③轻型或疾病早期的“亚临床状态”，尤其在反馈调节仅有细微的紊乱时，甚至测定上下游激素也不能提供足够支持诊断的信息因此，测定激素需要注意以下事项，才能得到对临床诊断有帮助的结果。

几乎所有激素都在反馈调控下，但胎盘激素、正常男性的雌激素和正常女性的雄激素是例外。同时测定上下游激素或激素与其调节物质可使临床医生得到更多信息。

同时测定激素对的血上下游激素水平后，根据测定结果可诊断如下：

提示原发病因位于产生上游激素的内分泌腺，如TSH 和T ₄ 值均低是垂体性TSH 分泌功能减退，血PTH 值和血钙均低是甲状旁腺功能减退的表现。

提示靶腺功能自主高分泌，如肾上腺皮质肿瘤分泌过多的皮质醇激素通过负反馈途径抑制垂体ACTH 的分泌，或甲亢表现为T ₄ 水平高，而TSH水平降低，除外外源性补充相应激素以后，提示靶腺功能亢进。

可能是：①原位或异位内分泌肿瘤促激素过量分泌，如垂体或肺类癌分泌过ACTH 产生ACTH 依赖性库欣综合征；②外周异位内分泌肿瘤分泌垂体激素释放激素，使垂体分泌过多的促激素，如异位分泌GHRH 所致的肢端肥大症，异位分泌CRH 所致的异位ACTH 综合征；③对靶激素的作用抵抗：如雄激素受体功能缺陷，对睾酮作用抵抗，导致LH 和T 均升高。糖皮质激素受体功能缺陷，导致ACTH 和皮质醇均高，但患者的临床表现没有靶腺激素过多的表现，反而呈现程度不一的靶腺激素缺乏的表现。

如血T ₄ 水平降低，伴有血TSH 值升高，说明甲状腺功能减退，垂体得不到足够的负反馈而代偿性分泌TSH 过多，原发性肾上腺皮质功能减退症患者也会出现皮质醇水平降低，而ACTH 水平增高的表现。值得注意的是亚临床靶腺功能减退的患者，靶腺激素可能尚在正常参考范围，但促激素已经开始升高提示靶腺的储备已经不足，临床上最常见到是亚临床甲状腺功能减退，此时T ₄ 在正常范围内，而TSH 水平已经开始升高。

临床上有时比较难鉴别的情况是促激素自主分泌还是对激素作用的抵抗，需要依据患者的临床表现，前者有激素过多的表现，后者临床表现为程度不一的激素缺乏。此外，疾病的相对发病率也对鉴别诊断有帮助，如糖皮质激素抵抗是极少见的，故ACTH 和皮质醇同时升高多数情况提示有ACTH 自主分泌；对于同时有LH 和T 水平升高，则雄激素不敏感综合征比垂体促性腺激素分泌腺瘤更常见，此外，前者表现为男性化不足或者呈现女性化，后者缺乏上述表现；在不恰当TSH 分泌过多的情况，会同时出现TSH 和T ₄ 升高的情况，因为垂体TSH 自主分泌瘤和甲状腺激素受体基因突变导致的甲状腺激素抵抗均较为罕见，此时需要依据更多的临床表现及进一步功能试验来帮助鉴别，针对致病基因的分子生物学诊断对这种少见情况具有重要鉴别意义 ^[30]。

在严重的内分泌功能亢进或减退时，测定一次血或尿激素水平，即可作出诊断。一些轻型、部分性、暂时性或失代偿的内分泌功能紊乱，可结合病情做以下检查。

有些疾病须多次测定血、尿激素水平数月甚至数年以上，方能得出诊断。如周期性库欣综合征、早期甲状旁腺功能亢进等。

正常人激素释放的节律变化较大，多数激素正常值是大系列正常人测得值的均数±标准差，个体值可与正常值相差较大。有正常的激素分泌节律者表明其内分泌功能正常，连续测定激素谱对其诊断有帮助，如GH 激素谱中有夜间入睡后的GH 分泌高峰，可排除GH 缺乏性身材矮小的诊断；夜间出现LH 脉冲分泌波是儿童进入青春发育期的最初表现。

对有特征性分泌规律的激素，根据节律来安排采血时间，对提供激素分泌状态很有帮助，如皮质醇分泌节律为午夜最低，清晨醒后出现分泌高峰，故测定清晨8 时及午夜血皮质醇水平，若无上述节律存在，尤其是午夜皮质醇水平升高，是库欣综合征的早期表现 ^[3]。

当基线状态的激素不足以给出诊断时，需要进行功能试验，一般来说，兴奋试验用于确认激素分泌不足，抑制试验用于确认激素过量。

此类试验用于：①怀疑内分泌功能减退，但血浆激素水平在正常低值，或难以确切定量时；②区分原发性和继发性内分泌功能减退；③帮助诊断一些内分泌功能亢进疾病，如甲状腺功能亢进时TSH 和TRH 的反应是减退的，甲状腺髓样癌患者，给予五肽胃泌素或钙后，降钙素分泌增加。常用的方法如下：

给予的促激素可以是下丘脑释放激素如GnRH、CRH 和TRH，也可以是垂体激素的激动剂，如人工合成的ACTH _1-24 来代替ACTH，HCG 代替LH。在每项试验中，靶腺的反应能力由血浆中被兴奋的靶腺激素如LH、ACTH、TSH、皮质醇或睾酮升高的水平和时间决定。

如静脉注射胰岛素以降低血糖，兴奋下丘脑神经元分泌释放激素，而使垂体分泌GH 和ACTH 增加。禁水试验通过限制水的摄入使血渗透压升高，兴奋下丘脑分泌ADH，肾小管回吸收水增加，尿量下降。

如测定睡眠或运动使患者垂体释放GH 的能力，或口服葡萄糖升高血糖，以观察机体此时应对血糖动态变化分泌胰岛素的能力。

如给予甲吡酮通过阻滞11β 羟化酶，影响皮质醇合成的最后几个步骤，皮质醇的合成减少，对下丘脑垂体的负反馈抑制能力减弱，ACTH 水平增加。

用反馈抑制剂去测定待测激素是建立在正常调节控制下。此类试验主要用于临床疑有内分泌功能亢进时。

如给予地塞米松，测定其抑制内源性ACTH 和皮质醇的能力，这是地塞米松抑制试验的机制。此外通过加大地塞米松剂量，大剂量地塞米松抑制试验还可以辅助鉴别高皮质醇血症的病因，如由于垂体腺瘤分泌过量ACTH 导致，大剂量地塞米松抑制试验可被抑制到基线的50%以下，而异位ACTH 综合征和肾上腺自主分泌皮质醇过多，该试验多不被抑制 ^[31，32]。

如口服葡萄糖后测试对GH 分泌的抑制，如为垂体生长激素瘤则GH 不能被抑制到1ng/ml 以下 ^[33]。另一个例子为静脉滴注钙剂测定PTH 分泌是否减少来鉴别患者是否因为甲状旁腺肿瘤引起的PTH 分泌增加 ^[2]。

如饥饿时血糖降低，可抑制胰岛素分泌，但胰岛素瘤患者仍有过量胰岛素分泌，不受生理性因素调节，最终患者在饥饿试验时出现低血糖 ^[34]。

如酚妥拉明可阻断儿茶酚胺作用于受体的效应，因此使嗜铬细胞瘤患者的血压下降 ^[1]。

解释内分泌功能试验时，须与对照人群的“正常反应范围”进行比较，应有正常人及应鉴别的疾病患者的对照值，对照组人数要够多。应考虑年龄对试验结果的影响，如男性激素分泌量少的男孩对HCG 兴奋试验的结果，血睾酮水平可无、轻度或正常增加。还应注意一些影响试验反应程度，如剧烈强体力训练的运动员，其ACTH 和皮质醇对促肾上腺皮质激素释放激素的反应比对照组为强。

长期继发于下丘脑垂体病变的靶腺萎缩所致的功能减退，须连续兴奋数日，靶腺方逐渐恢复反应。全身性甲状腺激素抵抗综合征有甲状腺肿大、血甲状腺激素水平升高、甲状腺吸碘率不低，虽临床上无明显症状，但仍不易与TSH 依赖性甲状腺功能亢进症鉴别，但若能证实TSH 对TRH 兴奋反应正常或升高，则可除外甲状腺功能亢进症的诊断。

如甲状腺功能亢进和减退可分别使皮质醇的转换率增加和延缓，影响甲吡酮测定垂体ACTH分泌储备的试验结果；甲状腺功能减退、库欣综合征、肥胖、低血钾均使GH 对兴奋的反应降低，而严重蛋白质缺乏引起的营养不良、肝硬化及慢性肾衰竭可使GH 基础值升高，甚至不被抑制；抑郁症患者GH 对左旋多巴的反应降低、皮质醇不被地塞米松抑制、TSH 对TRH 无反应；约1/5 的急性精神病患者血T ₄ 及游离T ₄ 升高。

药理剂量的糖皮质激素、黄体酮类药物及氯丙嗪可降低GH 对低血糖兴奋的反应；雌激素可加强GH 对低血糖的反应；苯妥英钠可加速地塞米松的代谢，致口服地塞米松后血药浓度水平降低，不能充分抑制皮质醇的分泌；苯妥英钠还促进细胞对T ₄ 的摄取和代谢，血游离T ₄ 水平下降、TSH 对TRH 反应受影响；口服大剂量阿司匹林后，促使甲状腺激素由甲状腺素结合蛋白解离，游离状态的甲状腺激素水平升高，也影响TSH 对TRH 的反应。多种降压药、利尿剂、螺内酯、血钾水平、饮食中的高钠状态均可影响肾素、醛固酮的测定。在患者服用上述药物的同时，需要提前停止相关药物服用才能得到准确的结果。

妊娠是人生的特殊阶段，此时不仅母体内多种激素会出现与孕前明显的不同，胎盘产生的各种激素也影响母亲外周血激素的水平。如胎盘产生的高雌激素状态可以刺激孕期催乳素瘤的生长。来自胎盘的生长激素能使妊娠期肢端肥大症的诊断变得困难。胎盘产生加压素酶增加加压素的降解，从而使亚临床尿崩症在妊娠期间显现，出现妊娠期尿崩症。妊娠剧吐可能由于高水平的人绒毛膜促性腺激素而导致短暂妊娠甲状腺功能亢进。妊娠期间皮质醇产生增加，同时尿游离皮质醇水平增加，而对地塞米松抑制试验不敏感，会使妊娠期库欣综合征的诊断变得困难 ^[35]。

T ₄ 约75%与甲状腺素结合球蛋白结合，10%～15%与白蛋白结合，10%～15%与转甲状腺素（前白蛋白）结合，只有0.04%为游离状态。妊娠期间胎盘中雌激素的增加导致肝细胞产生TBG 增加，降解减少，故TBG 水平从4～6 周开始升高，随之总T ₄ 水平也开始升高。妊娠期间，游离T ₄ 水平通常保持在正常范围内，但与HCG 的变化平行，游离T ₄ 水平在早孕期轻微升高至正常高值，之后回落至基线状态或者低于基线状态。TSH 水平在早孕期间有轻度降低，与游离T ₄ 水平升高相关，孕早期TSH 正常范围为0.1～2.5mU/L ^[36]。

皮质醇水平在整个妊娠期间逐渐增加。妊娠期皮质醇增加至孕前的2～3 倍。皮质醇的大部分升高是由于雌激素引起CBG 增加，故血中总皮质醇水平增加，但血清中的有生物活性“游离皮质醇”也会增加3 倍，故妊娠后24 小时尿游离皮质醇最高可以升高3 倍。

ACTH 水平在不同的报道中，在早孕期有正常、抑制和升高的三种状态，但随着孕周增加，ACTH 水平逐渐上升，最终在分娩时和皮质醇达到高峰。胎盘除了能产生CRH 外，也能产生少量ACTH，很难从常规检验方法来区分胎盘和垂体来源的ACTH，但妊娠期间ACTH 和皮质醇的昼夜节律存在提示循环中大部分ACTH 来源于垂体。

妊娠期间通常出现血压下降，在28 周达到最低点，之后逐渐恢复到接近孕前的血压水平。血浆肾素活性在8 周左右增加4 倍，在余下的32 周仅轻微增加。升高的肾素来自于卵巢、蜕膜和高浓度的雌激素刺激肾脏所致。血浆血管紧张素原在妊娠20 周前增加4 倍，之后在剩余20 周仅有轻微增加，血管紧张素Ⅱ在妊娠后逐渐增加，到足月时增加至3～4 倍。血浆醛固酮水平在妊娠16 周出现5 倍的增加，足月时增加至7～10 倍 ^[37]。

妊娠期间，大约25～30g 钙从母亲转移至胎儿，至孕晚期这种钙的转移为约300mg/d。此外，妊娠期间尿钙排泄也增多，有研究显示约20%左右的孕妇24 小时尿钙大于350mg。血清总钙水平总体上略有下降，从平均2.4mmol/L 降至约2.2mmol/L，平行于血清白蛋白的下降（从4.7g/dl降至3.2 g/dl），同时离子钙的水平保持稳定。循环中1，25-（OH） ₂-D ₃ 水平升高，而25-OH-D 水平保持不变。虽然肾脏是主要的1-羟基化部位，但胎盘中也有1-羟化酶，相当数量的25-OH-D 会在胎盘进行 1-羟基化，生成 1，25-（OH） ₂-D ₃，这样的机制保护了母体的钙稳态。PTH 在孕早期降至正常低值，之后上升到中等正常范围。此外，PTH相关蛋白（PTH related protein，PTHrp）可由胎盘、羊膜、蜕膜、脐带和乳腺组织产生 ^[38，39]。

妊娠期间垂体体积平均增大36%，主要是因为催乳素细胞的数量和体积增加了10 倍。生长激素细胞和促性腺激素细胞数量减少，而促肾上腺皮质激素细胞和促甲状腺激素细胞数量没有变化。

胎盘产生大量雌激素会刺激催乳素水平明显增加，黄体酮也已被报道在妊娠期间有刺激催乳素分泌增加的作用。催乳素升高的水平与垂体催乳素细胞大小和数目的增加相关。至分娩前，PRL水平可能会增加10 倍，超过200ng/ml 以上 ^[40]。

尽管妊娠早期会因雌激素升高而促进GH 的分泌，而且妊娠期间免疫活性的GH 有部分来源于胎盘的GH 变异体，但母亲GH 水平在整个妊娠期间保持稳定。妊娠中后期母亲血清IGF-1 浓度升高，可能与胎盘GH 变异体与催乳素共同作用的结果。

胎盘合成并分泌具有生物活性的促性腺激素释放激素（gonadotropin-releasing hormone，GnRH），但垂体促性腺激素的产生在整个妊娠期间都会下降，这表现为从妊娠10 周开始，外周血LH 和FSH 水平下降，可能是通过卵巢和胎盘产生的雌激素和孕激素水平升高和胎盘产生抑制素来抑制的。

总而言之，虽然目前先进的检测技术发展使得内分泌激素的测定变得越来越便捷，但采集标本时需要注意时间和体位，在解读结果时，需要结合上下游激素来判断是否异常。对于一些特殊情况，内分泌的功能试验仍然是重要的判断内分泌腺体是否存在功能异常的检查。

1.史轶蘩.协和内分泌代谢学.北京：科学出版社，1999

2.陈宝荣，朱惠娟.内分泌及代谢性疾病（实用临床检验诊断学丛书）.北京：北京科学技术出版社，2014

3.陆召麟等.内分泌内科学.北京：人民卫生出版社，2009

4.Shlomo Melmed，Kenneth S.Polonsky，P.Reed Larsen，et al.Kronenberg.Williams Textbook of Endocrinology.12 ^th ed.Philadelphia：Saunders，2012

5.Zhang L，Elias JE，Charles GD Brook，et al.Handbook of Clinical Pediatric Endocrinology.2 ^nd ed.Hoboken：John Wiley & Sons，2012

6.Murray R.D.，Melmed S.The Pituitary.Hoboken：John Wiley & Sons，2006

7.邓洁英，史轶繁，关炳江，等.人血清生长激素的放射免疫测定及其临床应用[J].医学研究通讯，1983，（1）：20-22

8.高素敏，邓洁英，史轶蘩.生长介素的放射免疫测定及初步临床应用[J].中华内分泌代谢杂志，1988，（4）：419-425

9.邓洁英，高素敏，史轶蘩.人血清泌乳素的放射免疫分析法[J].中华核医学杂志，1990，10（2）：115-116

10.吴从愿.血浆17-羟孕酮竞争性蛋白结合分析法[J].中华医学检验杂志，1981，4（2）：84-88

11.邓洁英，高素敏，何瑞娟，等.血清人生长激素的放射受体测定法[J].中国医学科学院学报，1989，11（5）：326

12.周学瀛，刘怀成，孟迅吾，等.不需高效液相层析的1，25-双羟维生素D 的放射受体测定法[J].中华内分泌代谢杂志，1989，5（2）：103-106

13.姬金凤，吴从愿.人血清生长激素免疫放射分析法的建立及初步临床应用[J].中华核医学与分子影像杂志，1992，12（4）：232-233

14.Andersen L，Dinesen B，Jørgensen PN，et al.Enzyme immunoassay for intact human insulin in serum or plasma[J].Clin Chem，1993，39（4）：578-582

15.L’Hermite-Balériaux M，Copinschi G，Van Cauter E.Growth hormone assays：early to latest test generations compared[J].Clin Chem，1996，42（11）：1789-1795

16.Khosravi MJ，Diamandi A，Mistry J，et al.Noncompetitive ELISA for human serum insulin-like growth factor-I[J].Clin Chem，1996，42（8 Pt 1）：1147

17.Bolstad N，Warren D J，Nustad K.Heterophilic antibody interference in immunometric assays[J].Best Pract Res Clin Endocrinol Metab，2013，27（5）：647-661

18.Zhang L，Elias JE.Relative Protein Quantification Using Tandem Mass Tag Mass Spectrometry[J].Methods Mol Biol，2017，1550：185-198

19.Patrie SM.Top-Down Mass Spectrometry：Proteomics to Proteoforms[J].Adv Exp Med Biol，2016，919：171-200

20.李水军，Sihe Wang.液相色谱-质谱联用技术临床应用.上海：上海科学技术出版社，2014

21.王思合.临床色谱质谱检验技术.北京：人民卫生出版社，2017

22.Vogeser M，Parhofer KG.Liquid chromatography tandemmass spectrometry（LC-MS/MS）—technique and applications in endocrinology[J].Exp Clin Endocrinol Diabetes，2007 Oct，115（9）：559-570

23.Hines JM，Bancos I，Bancos C，et.al.High-Resolution，Accurate-Mass（HRAM）Mass Spectrometry Urine Steroid Profiling in the Diagnosis of Adrenal Dis orders[J].Clin Chem，2017，63（12）：1824-1835

24.Yu S，Zhou W，Wang D，et al.Rapid liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for determination of 24，25（OH）2D and 25OHD with efficient separation of 3-epi analogs[J].J Steroid Biochem Mol Biol，2018，pii：S0960-0760（18）30589-305892

25.Yu S，Zhou W，Zhang R，et al.Validation and comparison of a rapid liquid chromatography tandem mass spectrometry method for serum 25OHD with the efficiency of separating 3-epi 25OHD3[J].Clin Biochem，2016，49（13-14）：1004-1008

26.Yu S，Zhou W，Cheng X，et al.Blood Collection Tubes and Storage Temperature Should Be Evaluated when Using the Siemens ADVIA Centaur XP for Measuring 25-Hydroxyvitamin D[J].PLoS One，2016，11（11）：e0166327

27.Yu S，Cheng X，Fang H，et al.25OHD analogs and vacuum blood collection tubes dramatically affect the accuracy of automated immunoassays[J].Sci Rep，2015，5：14636

28.Yu S，Yin YC，Wang DC，et al.Development and validation of a simple isotope dilution-liquid chromatographytandem mass spectrometry method for detecting vitamins A and E in serum and amniotic fluid[J].Int J Mass Spectrom，2019，435：118-123

29.Wang D，Yu S，Zhang Y，et al.Rapid liquid chromatography-tandem mass spectrometry to determine verylong-chain fatty acids in human and to establish reference intervals for the Chinese population[J].Clin Chim Acta，2019，495：185-190

30.Koulouri O，Moran C，Halsall D，et al.Pitfalls in the measurement and interpretation of thyroid function tests[J].Best Pract Res Clin Endocrinol Metab，2013，27（6）：745-762

31.Nieman LK，Biller BM，Findling JW，et al.The diagnosis of Cushing’s syndrome：an Endocrine Society Clinical Practice Guideline[J].J Clin Endocrinol Metab，2008，93（5）：1526-1540

32.Nieman LK，Biller BM，Findling JW，et al.Treatment of Cushing’s Syndrome：An Endocrine Society Clinical Practice Guideline[J].J Clin Endocrinol Metab，2015，100（8）：2807-2831

33.Katznelson L，Laws ER Jr，Melmed S，et al.Acromegaly：an endocrine society clinical practice guideline[J].J Clin Endocrinol Metab，2014，99（11）：3933-3951

34.Guettier JM，Lungu A，Goodling A，et al.The role of proinsulin and insulin in the diagnosis of insulinoma：a critical evaluation of the Endocrine Society clinical practice guideline[J].J Clin Endocrinol Metab，2013，98（12）：4752-4758

35.Costa MA.The endocrine function of human placenta：an overview[J].Reproductive biomedicine online，2016，32（1）：14-43

36.De Groot L，Abalovich M，Alexander EK，et al.Management of thyroid dysfunction during pregnancy and postpartum：an Endocrine Society clinical practice guideline[J].J Clin Endocrinol Metab，2012，97（8）：2543-2565

37.Kamoun M，Mnif MF，Charfi N，et al.Adrenal diseases during pregnancy：pathophysiology，diagnosis and management strategies[J].Am J Med Sci，2014，347（1）：64-73

38.Parkes I，Schenker JG，Shufaro Y.Parathyroid and calcium metabolism disorders during pregnancy[J].Gynecol Endocrinol，2013，29（6）：515-519

39.Cooper MS.Disorders of calcium metabolism and parathyroid disease[J].Best Pract Res Clin Endocrinol Metab，2011，25（6）：975-983

40.Chrisoulidou A，Boudina M，Karavitaki N，et al.Pituitary disorders in pregnancy[J].Hormones（Athens，Greece），2015，14（1）：70-80