三、免疫技术

免疫技术是利用抗原与抗体的特异性结合作用来选择性识别和测定待测物的一种技术。免疫技术起始于20世纪50年代，首先应用于体液大分子物质的分析。1960年，美国学者Yalow和Berson等将放射性同位素示踪技术和免疫反应结合起来测定糖尿病人血浆中的胰岛素浓度，开创了放射免疫分析方法的先河。之后相继出现了竞争蛋白结合分析、免疫放射分析和受体结合分析，以及以酶、荧光素、化学发光和生物发光等非放射性标记的免疫分析。现在免疫检测技术已广泛应用于生物科学的各个领域。这里主要介绍双向免疫扩散及免疫电泳、酶联免疫吸附法。

（一）双向免疫扩散及免疫电泳

将可溶性抗原（如小牛血清）与相应抗体（如兔抗小牛血清的抗体）混合，当两者比例合适且有电解质（如氯化钠、磷酸盐等）存在时，即有抗原—抗体复合物的沉淀出现，此为沉淀反应（precipitin reaction）。如以琼脂凝胶为支持介质，则在凝胶中出现可见的沉淀线、沉淀弧或沉淀峰。根据沉淀出现与否及沉淀量的多寡，可定性、定量地检测出样品中抗原或抗体的存在及含量。免疫学的一些测定方法即基于此特性。双向扩散法（double diffusion）最早由Ouchterlo-ny创立，故又称Ouchterlony法。此法是利用琼脂凝胶为介质的一种沉淀反应。琼脂凝胶是多孔网状结构，大分子物质可以自由通过，这种分子的扩散作用使分别两处的抗原和相应抗体相遇，形成抗原—抗体复合物，比例合适时出现沉淀。由于凝胶透明度高，可直接观察到复合物的沉淀线（弧）。沉淀线（弧）的特征与位置取决于抗原相对分子质量的大小、分子结构、扩散系数和浓度等因素。当抗原、抗体存在多种系统时，会出现多条沉淀线（弧）。依据沉淀线（弧）可以定性抗原。此法操作简便、灵敏度高，是最为常用的免疫学测定抗原和测定抗血清效价的方法。

免疫电泳法（immunoelectrophoresis）是在凝胶介质中将电泳法与扩散法相结合的一种免疫化学方法，用以研究抗原和抗体。免疫电泳是使血清在琼脂或琼脂糖中进行的电泳。在一定电场强度下，由于血清中各种免疫球蛋白的分子大小以及荷电状态和荷电量均有差异，因而它们的泳动速率也各不相同，加上电泳过程中电渗作用的影响，使各组分得到分离。在一定电场强度下，抗原与相应抗体在琼脂介质中加速扩散相遇而形成复合物沉淀。这种检测方法称作电免疫扩散法（electroimmunodiffusion）。由于操作方法不同，电免疫扩散法可分为对流免疫电泳（countercurrent immunoelectrophoresis）、交叉免疫电泳（crossed immunoelectrophoresis）和火箭免疫电泳（rocket immunoelectrophoresis）。

（二）酶联免疫吸附法

酶免疫分析法（enzyme immunoassay，EIA）或免疫酶技术（immunoenzymatic technique）是20世纪60年代发展起来的一种新的免疫测定法，是以酶标记的抗体或抗原为主要试剂的方法，是标记免疫技术的一种。目前常用的方法为酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）。其基本原理是将抗原或抗体吸附在固相载体表面，并保持其免疫活性，加入酶标抗体或抗原。这种酶标抗体或抗原既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，使受检标本和酶标抗体或抗原与固相载体表面的抗原或抗体起反应，形成酶标记的免疫复合物，通过洗涤，洗去游离的酶标抗体或抗原，而形成的酶标免疫复合物不能被洗去，当加入酶的底物时，底物被酶催化生成有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色的深浅对标本中的抗原或抗体进行定性和定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。常用于标记的酶有辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）等。ELISA常用的方法包括直接酶联免疫吸附法、间接酶联免疫吸附法、双抗体夹心酶联免疫吸附法和竞争酶联免疫吸附法。

（1）直接酶联免疫吸附法（direct ELISA）是指酶标抗原或抗体直接与吸附在酶标板上的抗体或抗原结合形成酶标抗原—抗体复合物，加入酶反应底物，测定产物的吸光值，计算出吸附在酶标板上的抗体或抗原的量。

（2）间接酶联免疫吸附法（indirect ELISA）是检测抗体最常用的方法，其原理是将特异性抗原与固相载体结合，形成固相抗原，加入受检标本，标本中的特异性抗体与固相抗原结合，形成固相抗原—抗体复合物，经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体，加入酶标抗抗体，它与固相复合物上的抗体相结合，从而使该抗体间接地标记上酶，洗涤后固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量，因此加入底物显色，颜色深度就代表受检标本中抗体的量。

（3）双抗体夹心酶联免疫吸附法（double antibody sandwich，DAS-ELISA）是将特异性抗体吸附到固相载体上，加入含有待测抗原的样品，使抗原与固相载体上特异性抗体反应，洗涤除去未反应的样品，加入酶标记的特异性抗体与抗原反应，最后加入底物显色。本法只适用于较大分子抗原的分析，而不能用于半抗原等小分子的测定。

（4）竞争酶联免疫吸附法（competing ELISA）可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗体为例，受检抗体与酶标记抗体竞争与固相抗原结合，因此结合于固相的酶标抗体量与受检抗体的量呈反比。