二、生物大分子的分离技术
（一）离心技术
离心技术就是利用旋转运动的离心力，以及物质的沉降系数或浮力密度的差别进行分离、浓缩和提纯的一项操作技术。
1.原理
当悬浮液静止不动时，由于重力的作用，较大的悬浮颗粒会逐渐沉降，颗粒越重下沉越快，反之会上浮。颗粒在重力场下移动的速度与颗粒的大小、形态、密度、重力场的强度及液体的黏度有关。如红细胞颗粒，直径为数微米，可以在通常重力作用下观察到它们的沉降过程。此外，颗粒在介质中沉降时还伴随有扩散现象。对小于几微米的颗粒如病毒或蛋白质等，它们在溶液中呈胶体或半胶体状态，仅仅利用重力是不可能观察到沉降过程的，因为颗粒越小沉降越慢，而扩散现象则越严重。这样可以利用旋转产生的离心力代替重力，使之产生沉降。
2.离心力和相对离心力
离心作用是根据在一定角度速度下作圆周运动的任何物体都受到一个向外的离心力进行的。离心力（Fc）的大小等于离心加速度ω2x与颗粒质量m的乘积，即：
F c =mω 2 x
式中 ω——旋转角速度，rad/s；
x——颗粒离开旋转中心的距离，cm；
m——质量，g。
很显然，离心力随着转速和颗粒质量的提高而加大，而随着离心半径的减小而降低。
目前离心力通常以相对离心力（relative centrifugal force，RCF）表示，即离心力Fc的大小相对于地球引力（G）的多少倍，单位为g，其计算公式如下：
式中 x——离心转子的半径距离，cm；
g——地球重力加速度（980cm/s2）；
n——转子每分钟的转数，r/min。
在说明离心条件时，低速离心通常以转子每分钟的转数表示（r/min），如4000r/min；而在高速离心时，特别是在超速离心时，往往用相对离心力来表示，如65000r/min。
3.沉降速度与沉降系数
沉降速度（sedimentation velocity，v）是指在离心力作用下，单位时间内颗粒沉降的距离：
式中 r——球形粒子半径；
d——球形粒子直径；
η——流体介质的黏度；
ρp——粒子的密度；
ρm——介质的密度。
从上式可知，粒子的沉降速度与粒子直径的平方、粒子的密度和介质密度之差成正比；离心力增大，粒子的沉降速度也增加。
沉降系数（sedimentation coefficient，S）是指在单位离心力的作用下，待分离颗粒的沉降速度
S的单位为s，在实际应用时常在10-13s左右，为了纪念离心技术早期的奠基人Svedberg，而把10-13s称为一个Svedberg单位（S），即 1S=10-13s。近年来，在生物化学、分子生物学及生物工程等书刊文献中，对于某些大分子化合物，当它们的详细结构和相对分子质量不很清楚时，常常用沉降系数这个概念去描述它们的大小。如核糖体RNA（rRNA）有30S亚基和50S亚基，这里的S就是沉降系数，现在更多地用于生物大分子的分类，特别是核酸。
4.离心方法
根据离心原理，可设计多种离心方法，常见下列三大类型：
（1）沉淀离心 沉淀离心技术是目前应用最广的一种离心方法。一般是指选用一种离心速度，使悬浮溶液中的悬浮颗粒在离心力的作用下完全沉淀下来，这种离心方式称为沉淀离心。离心时可根据颗粒大小来确定沉降所需要的离心力。主要适宜于细菌等微生物、细胞和细胞器等生物材料，及病毒和染色体DNA等的离心分离。
（2）差速离心法 利用不同的粒子在离心力场中沉降的差别，在同一离心条件下，沉降速度不同，通过不断增加相对离心力，使一个非均匀混合液内的大小、形状不同的粒子分部沉淀。操作过程中一般是在离心后倾倒，把上清液与沉淀分开，然后将上清液加高转速离心，分离出第二部分沉淀，如此往复加高转速，逐级分离出所需要的物质。差速离心的分辨率不高，沉淀系数在同一个数量级内的各种粒子不容易分开，常用于其他分离手段之前的粗制品提取。
（3）密度梯度离心法 密度梯度离心技术是指离心前在离心管内先装入分离介质，形成连续的或不连续的密度梯度介质，然后加入样品进行离心，根据操作方法的不同，密度梯度离心法又可分为速率区带离心和等密度梯度离心。
（二）层析技术
层析法又称色谱法或色层法，开始由分离植物色素而得名，后来不仅用于分离有色物质，而且在多数情况下用于分离无色物质。层析法是近代生物化学最常用的分析方法之一，此种方法可以分离和鉴定性质极为相似，而且用一般化学方法难以分离的多种化合物，如氨基酸、蛋白质、糖、脂类、核苷酸、核酸等。
1.原理
层析法是利用混合物各组分物理化学性质（溶解度、吸附能力、电荷、分子大小与形状及分子亲和力等）的差别建立起来的技术。所有的层析系统都由两个相组成：一是固定相，它是固体物质或者是固定于固体物质上的成分；另一是流动相，即可以流动的物质，如水和各种溶媒。当待分离的混合物随流动相通过固定相时，不断进行着交换、分配、吸附、解吸等过程，由于各组分的理化性质存在差异，与两相发生相互作用的能力不同，所受固定相的阻滞作用和受流动相推动作用的影响各不相同，从而使各组分以不同速度移动而达到彼此分离的目的。
2.分类
层析根据不同的标准可分为多种类型，按原理不同可分为吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析和亲和层析等；按照装置形式不同，可分为纸层析、薄层层析和柱层析等；按照流动相状态不同，可分为气相层析和液相层析等。现将几种层析技术简介如下。
（1）分配层析 分配层析是利用混合物中各组分在两相中分配系数不同而使之分离的层析技术，相当于一种连续性的溶剂抽提方法。分配系数是指某物质在两相溶液中溶解达平衡时的浓度比。如以一些吸附力小、反应性弱的惰性支持物（如淀粉、纤维素粉、滤纸等）上结合的水作为固定相，加入不与水混合或仅部分混合的溶剂作为流动相，由于混合物各组分在两相中发生不同的分配而逐渐分开，形成层析谱。固定相除水外，也可用稀硫酸、甲醇、仲酰胺等强极性溶液，流动相则采用比固定相极性小或非极性的有机溶剂。
（2）吸附层析 某些物质如氧化铝、硅胶等具有吸附其他物质的性质，而且对各种被吸附物质的吸附能力不同，利用这种差异可将混合物分离。吸附力的强弱，除与吸附剂本身的性质有关外，也与被吸附物质有关。根据操作装置的不同，吸附层析可分为柱层析与薄层层析两种。
（3）离子交换层析 离子交换层析是利用离子交换剂对需要分离的各种离子有不同的亲和力，使离子在层析柱中移动时达到分离的目的。离子交换剂具有酸性或碱性基团，分别能与水溶液中阳离子或阴离子进行交换。它的交换过程是溶液中的离子穿过交换剂的表面，到交换剂颗粒之内，与交换剂的离子互相交换。由于各种离子所带电荷的多少不同，它们对交换剂的亲和力就有所差别。因此，在洗脱过程中，各种离子由固体柱上先后下来的顺序不同，从而可达到分离的目的。这种交换是定量完成的，因此测定溶液中由固体上交换下来的离子量，可知样品中原有离子的含量；也可将吸附在交换剂上的样品成分用另一洗脱液洗脱下来，再进行定量。
（4）凝胶层析 凝胶层析主要是根据多孔凝胶对不同大小分子的排阻效应不同而进行分离。排阻是指大分子不能进入小的胶孔中而被阻留在凝胶颗粒之外，而小分子则可进入凝胶孔内部的现象。凝胶层析分离物质的分子质量范围是0.1～105ku。目前使用的商品凝胶如琼脂糖凝胶可分离物质的分子质量即可达105ku，故可用以分离巨分子质量的蛋白质、酶和核酸。凝胶层析还可应用于微量放射性物质的分离和蛋白质分子质量的测定。
（三）电泳技术
电泳是指在电场中的带电粒子向电性相反方向发生位移的现象。电泳现象早在19世纪初就被人们发现，到20世纪初Field及Teague曾用电泳技术研究白喉毒素，但未引起人们的重视。直到1937年瑞典生物化学家Tiselius制成了界面电泳仪，并对血清蛋白进行了电泳，把血清蛋白分成清蛋白、α-、β-、γ—球蛋白四种。从此以后，电泳的种类和应用在深度和广度两方面均得到迅速发展，成为生物化学与分子生物学技术中分离、鉴定生物大分子的重要手段。由于电泳技术操作简单、快速、灵敏等优点，故已在生物化学、分子生物学、医学、药学、食品、农业环保等学科得到广泛应用，并成为蛋白质、核酸分析鉴定的主要技术之一。
1.原理
生物大分子如蛋白质、核酸、多糖等大多都有阳离子和阴离子基团，称为两性离子。常以颗粒分散在溶液中，它们的静电荷取决于介质的H+浓度或与其他大分子的相互作用。在电场中，带电颗粒向阴极或阳极迁移，迁移的方向取决于它们所带的电性，这种迁移现象即所谓电泳。如果把生物大分子的胶体溶液放在一个没有干扰的电场中，使颗粒具有恒定迁移速率的驱动力来自于颗粒上的有效电荷Q和电位梯度E。它们与介质的摩擦阻力f相等。在自由溶液中摩擦力服从Stokes定律。
QE =6πrvη
式中 r——颗粒的半径；
v——颗粒的移动速度；
η——介质的黏度。
由此可见，在同一电泳条件下，不同带电颗粒因其分子大小和带电量的不同具有不同的泳动速度。因此电泳一定时间，就能相互分开。不同物质的电泳性质常用迁移率来表示。迁移率（m，又称泳动率）是指带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度。
迁移率的不同提供了从混合物中分离物质的基础，迁移距离正比于迁移率。带电分子由于各自的电荷和形状大小不同，因而在电泳过程中具有不同的迁移速度，形成了依次排列的不同区带而被分开。即使两个分子具有相似的电荷，如果它们的分子大小不同，由于它们所受的阻力不同，因此迁移速度也不同，在电泳过程中就可以被分离。有些类型的电泳几乎完全依赖于分子所带的电荷不同进行分离，如等电聚焦电泳；而有些类型的电泳则主要依靠分子大小的不同即电泳过程中产生的阻力不同而得到分离，如SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。分离后的样品通过各种方法的染色，或者如果样品有放射性标记，则可以通过放射性自显影等方法进行检测。
2.电泳的分类
电泳技术根据不同的标准可以分为不同的类型。以支持物分，可分为纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、淀粉凝胶电泳、琼脂（糖）凝胶电泳及聚丙烯酰胺凝胶电泳等。按凝胶形状分有水平平板电泳、圆盘电泳、柱状电泳及垂直平板电泳。现将几种电泳技术简介如下。
（1）醋酸纤维薄膜电泳（cellulose acetate electrophoresis，CAE）醋酸纤维薄膜电泳是以醋酸纤维薄膜作为支持物的一项电泳技术。醋酸纤维分子中每个葡萄糖单位的两个游离羟基均与醋酸脱水缩合，生成二乙酰葡萄糖。常用于血清蛋白、同工酶的分离。
（2）琼脂糖凝胶电泳（agarose gel electrophoresis，AGE）琼脂糖凝胶电泳是以琼脂糖凝胶作为支持物的一项电泳技术。琼脂糖是由琼脂经处理去除其中的果胶成分而得，化学组成是一类由多个D—半乳糖-O-3，6—脱水—L—半乳糖彼此连接而成的线性多糖，在形成凝胶时主要通过氢键相互交联。常用于血浆脂蛋白、免疫球蛋白、同工酶和DNA酶切片段的电泳分离。
（3）聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持物的一项电泳技术。根据凝胶系统的均匀性，聚丙烯酰胺凝胶电泳可以分为连续性凝胶电泳和不连续性凝胶电泳系统。连续性凝胶电泳是指整个电泳系统中所用的凝胶网孔、缓冲液及pH都是相同的，电泳时沿电泳方向的电势梯度均匀分布，按常规区带电泳施加电压进行操作，简单易行；不连续凝胶电泳是指电泳系统中采用两种或两种以上的缓冲液、pH和凝胶孔径，电泳过程中形成的电势梯度不均匀，能将较稀的样品浓缩成密集的区带，从而提高分辨率。
（四）膜分离技术
1.原理
膜分离技术是生物大分子分离技术中一个重要的组成部分，尤其是在生物大分子的规模化制备中有其独特作用。早在1861年Thomas Graham就利用简易的膜分离技术将大分子和无机盐进行了初步分离。当时的膜材料主要是动物膜或动物胶。
膜分离技术来源于过滤技术，是借助半透膜相隔的不等渗的两相液体，利用具有不同截留分子质量的半透膜，通过渗透压或外加一定工作压，使高渗溶液中的小分子穿过半透膜的膜孔进入低渗溶液一侧，生物大分子被截留在膜的高渗溶液一侧。凡是利用薄膜技术进行分离的方法，称为膜分离技术。膜分离技术是大分子与小分子的分离，是一种微观的分子之间的分离技术。在实验室研究和工业化生产中的应用也越来越广泛。
膜分离技术所用的膜材料为半透膜。半透膜除了动物膜外，还有由纤维素衍生物制成的羊皮纸，玻璃纸管状半透膜。半透膜在溶液中能迅速溶胀形成能让小于膜孔直径的小分子自由通过的薄膜，具有化学稳定性和抗拉能力。不同型号的半透膜，溶胀后孔径的大小不同，可以截留不同大小的生物分子。
2.分离方法
（1）自由扩散透析法 根据样液的体积截取一段管状半透膜，放入蒸馏水中溶胀一段时间，在半透膜一端用透析夹夹死或用线绳捆紧制成一个盲端的圆形口袋，把样品液转移到袋内，然后将袋上端用同样的方式捆紧，放入蒸馏水或低渗溶液中透析。由于透析袋内的溶液渗透压高，小分子自由扩散到低渗溶液中，大分子被阻止在袋内。当袋内的小分子与袋外小分子趋于平衡时，更换一次蒸馏水，会产生新的渗透压差，小分子继续往外扩散，如此重复几次，就可以将大分子和小分子分离。
（2）搅拌透析 搅拌透析的方式与自由扩散式相似，前者在透析容器下面安装一个电磁搅拌器，透析容器内的蒸馏水在电磁搅拌的作用下，形成一个涡旋流，自由扩散出来的小分子很快被分散到个容器中，使透析袋外周始终保持低渗状态，节省透析时间提高透析效率。
（3）连续流透析 连续流透析是将需要透析的样液装入透析袋内，悬挂在空中，利用重力差，透析袋内的小分子挤出透析膜外，然后通过蠕动泵将蒸馏水输送到透析袋的顶端，蒸馏水沿透析袋的四周往下淋洗，并将渗出的小分子带走。这种透析方式不但能使透析袋外周始终保持低渗状态，而且还有效地阻止了溶剂分子进入袋内，起到浓缩作用。
（4）反流透析 反流透析是使样液和蒸馏水在半透膜的两侧缓缓流动，两相溶液都处于动态透析状态，既有较大的透析面积，又能使膜内外的浓度差达到最大限度，提高了透析效率。这种装置是将需要透析的样液由输液泵从膜内的底部注入，流向向上，蒸馏水从膜外的顶部注入，流向向下。使膜两侧分别形成不同流向的、不等渗的溶液，克服了透析袋内外两相溶液所形成的浓度差，极大地提高了透析的效率，但是这种透析装置操作比较麻烦。