学习任务3培养基制备技术

【学习目标】 1．掌握植物组织培养基的主要成分及常用培养基的配方。

2．能独立进行培养基母液的配制。

3．能按照配方要求制备培养基。

【工作情境】 植物组织培养是一项技术性很强的工作。为了确保组织培养工作顺利进行，除了具备基本的实验设备条件，还要熟练掌握植物组织培养的基本技术，其中培养基的配制是主要技术之一。培养基配制通常需要预先配制好各种营养物质及生长调节物质的母液，再根据培养基的配方及培养基的配制量，依次计算并量取各种母液的体积，经混合及添加其他物质充分溶解后，分装于相应的培养容器内，再经高温高压灭菌。

【工作流程】

以MS培养基为例进行学习。

图3-1培养基制备流程图

学习活动1 培养基的成分及常用培养基的特点

【学习目标】 明确培养基的基本成分、常用培养基的配方及特点。

【学习准备】 常用培养基成分的主要化学物质、常用的培养基介质。

【学习过程】

问题1

培养基中的化学物质主要为植物材料提供营养元素，植物所需要的营养元素主要有氮（N）、磷（P）、钾（K）、钙（Ca）、镁（Mg）、硫（S）、铁（Fe）、硼（B）、锰（Mn）、锌（Zn）、铜（Cu）、钼（Mo）、铝（Al）等。那么，在中学里我们学到的哪些化学物质中含有这些元素呢？

基本知识

一、培养基的概念

培养基是根据植物的需求，将人工配制的含有各种营养成分的营养液盛装于一定的容器内，并经高温高压灭菌后的培养基质。培养基是植物组织培养的核心，也是决定植物组织培养成败的关键因素之一。外植体之所以能沿着不同的组织培养途径生长、分化，主要原因就在于培养基中的物质成分对细胞的生长发育起着定向调控作用。

在离体培养条件下，不同植物的组织对营养的要求不同，甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同。因此，在进行植物组织培养时，首先必须找到一种合适的培养基，培养才有可能成功。

二、培养基的成分

图3-1-1培养基成分

（一）水分

水分是离体植物生长所必需的成分。在培养基制备过程中所用的水必须是蒸馏水或纯水，以免水中杂质以及所含矿质元素离子对培养结果产生影响。

（二）无机养分

指在植物生长发育中所必需的各种矿质元素、无机盐等。根据植物对矿质元素的吸收量，将无机养分分为大量元素和微量元素两大类。

1．大量元素：植物所需浓度大于0.5 mmol/L的元素，主要有氮、磷、钾、钙、镁、硫、碳及来源于水中的氢和氧。

2．微量元素：植物所需浓度小于0.5 mmol/L的元素，主要有铁、锰、锌、铜、硼、碘、钼和钴等。

3．各种矿质元素的生理作用及缺乏时的症状如表3-1-1所示。

表3-1-1各种矿质元素的生理作用及缺乏时的症状

续表

（三）有机养分

培养基中还需要加入一定量的有机养分以利于植物快速生长。有机养分是指植物生长发育所需的有机碳、氢、氮等物质，主要有各种维生素、肌醇、氨基酸等。

1．维生素：维生素以辅酶的形式参与多种酶系的反应，直接影响蛋白质、糖、脂肪等物质的代谢活动，对离体植物生长、分化有很好的促进作用。常用的维生素有盐酸硫胺素（维生素B1）、盐酸吡哆醇（维生素B6）、钴胺素（维生素B12）、叶酸（维生素B9）、抗坏血酸（维生素C）等。其中，维生素B1可全面促进植物的生长；维生素C有抗氧化作用，防止褐变；维生素B6能促进根的生长。维生素遇热易变性，易在高温下降解，可进行过滤灭菌。

2．肌醇：肌醇是维生素B族中的一种，又称为环己六醇，主要在糖的互相转化中起作用，具有促进活性物质发挥作用的效果，能使培养的植物组织快速生长。肌醇还能促进愈伤组织生长、胚状体和芽的形成，培养基中1 mg/L的肌醇足够促进盐酸硫胺素效应的发挥。

3．氨基酸：氨基酸是蛋白质的组成成分，也是一种有机氮源，对植物外植体芽、根、胚状体的生长、分化均有良好的促进作用。植物组织培养中常用的氨基酸有丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、酪氨酸、天门冬氨酸以及多种氨基酸的混合物，如水解酪蛋白、水解乳蛋白等。其中，甘氨酸能促进根的生长；丝氨酸和谷氨酰胺有利于花药胚状体或不定芽的分化；半胱氨酸可作为抗氧化剂，防止培养材料褐化，延缓酚氧化。

另外，培养基中还加入一些天然的有机物，如椰子乳、酵母提取液、麦芽提取液及各种果汁、菜汁等。天然有机物中常含有植物激素和多种维生素等成分，对某些植物组织的生长和分化有特殊的作用。

4．生长调节物质：生长调节物质在植物的生长分化和器官发育过程中起着非常重要的作用，它是培养基中的关键物质，用量虽少，但对外植体愈伤组织的诱导和根、芽等器官的分化起到重要和非常明显的作用。培养基中生长调节物质的使用必须根据所培养的植物组织种类及培养目的来确定。组织培养中常用的生长调节物质主要有以下几类。

（1）生长素：主要作用是促进植物细胞的伸长生长和细胞分裂，促进根的形成，诱导愈伤组织的产生，促进细胞脱分化。常用的生长素有吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）、2,4- 二氯苯氧乙酸（2,4-D）等。在生理活性上，2,4-D活性最强， NAA、IBA居中，IAA最弱，但是2,4-D有抑制芽形成的副作用，一般用于愈伤组织的诱导。

（2）细胞分裂素：具有促进细胞分裂、诱导芽的分化和生长以及抑制顶端优势的作用，能延缓叶片老化。常用的细胞分裂素有6-苄氨基嘌呤（6-BA）、6-糠氨基嘌呤（6-KT）、2-异戊烯基腺嘌呤（2-ip）、玉米素（ZT）等。

（3）赤霉素：以GA3运用最广泛，有促进不定芽和幼株伸长的作用。

另外，植物组织培养中还用脱落酸、多效唑等植物生长调节物质。

5．糖：糖不仅能提供给植物培养材料所需的碳源，也能维持一定的渗透压。常用的有蔗糖、葡萄糖、果糖和山梨糖等，最常用的是蔗糖。在规模化生产中从经济适用的角度出发，可利用白糖作为碳源。

（四）其他物质

在培养基中，往往根据培养目的、植物材料的不同，加入其他添加物，如活性炭、抗生素、抗氧化剂、诱变剂、生长抑制剂等。

1．活性炭：是木炭粉碎后经加工形成的粉末状物质，结构疏松，孔隙大，有很强的吸附作用，它的颗粒大小决定着吸附能力，粒度越小，吸附能力越大。温度低，吸附力强；温度高，吸附力减弱，甚至解吸附。通常使用浓度为0.5~10 g/L。它可以吸附非极性物质和色素等大分子物质，包括琼脂中所含的杂质，培养物分泌的酚、醌类物质以及蔗糖在高压消毒时产生的5- 羟甲基糖醛及激素等，防止植物组织培养中的褐变现象，同时对防止产生玻璃化苗和促进试管苗生根有明显的作用。

2．抗生素：在培养基中加入抗生素可防止菌类污染，减少培养基中材料的损失。常用的抗生素有青霉素、链霉素、土霉素、金霉素等。

3．抗氧化剂：植物组织在切割时会溢出一些酚类物质，接触空气中的氧气后，氧化为醌类物质，使植物材料和培养基变为褐色（即褐变现象），严重时植物材料死亡。所以褐变现象也是植物组织培养中的一大难题。在培养基中加入抗氧化剂可减轻褐变现象。常用的抗氧化剂有抗坏血酸、二硫苏糖醇、谷胱甘肽等。

4．琼脂：琼脂不是培养基中的营养成分，而是一种凝固剂。琼脂是从海藻中提取出来的高分子糖类，在水中需加热至95℃时才开始溶化，溶化后的溶液温度需降到40℃时才开始凝固，所以是配制固体培养基最好的凝固剂。琼脂本身不提供任何营养成分，具有无毒、可塑、遇热溶化、冷却后固形化、可使各种可溶性物质均匀分布等特性，因此是目前固体培养基中最好最常用的凝固剂。琼脂用量过高培养基变硬，过低培养基不凝固。

问题2

我们知道，不同的植物对营养条件的要求不同，而且同一种植物的不同器官和组织的再生能力也不同，也就是说在植物组织培养中，要根据不同的植物、不同的培养部位及不同的培养目的选用不同的培养基。那么，在植物组织培养中如何选择适宜的培养基呢？

基本知识

三、常用培养基的类型

（一）按照培养基的营养水平分

1．基本培养基：就是通常所说的培养基，只含有植物材料所需的基本营养成分，如MS、B5、Miller、White培养基等。

2．完全培养基：在基本培养基的基础上，根据实验的不同要求，附加一些物质，如生长调节物质等。

（二）按照培养基的物理状态分

1．固体培养基：在培养基中加入凝固剂的培养基，多为琼脂。

2．液体培养基：液体培养基中不加任何凝固剂。这种培养基的成分均匀，培养材料能充分接触和利用培养基中的养料。

3．半固体培养基：液体培养基中加入少量凝固剂而呈半固体状态。它有利于培养材料对营养物质的吸收。

（三）按照培养物的培养过程分

1．初代培养基：是指第一次用来接种外植体的培养基。

2．继代培养基：是指用来接种初代培养之后的培养物的培养基。

（四）按照培养基的作用分

诱导培养基、增殖培养基、生根培养基。

四、常用培养基的配方

植物组织培养是否成功，在很大程度上取决于对培养基的选择。不同培养基有不同的特点，适用于不同的植物种类和接种材料。开展植物组织培养活动时，应对各种培养基进行了解和分析，以便从中选择使用。培养基中的激素种类和浓度，随着培养阶段和材料的不同而有变化，因此各配方中均不列入。

植物组织培养中常用的培养基有MS、White、N6、B5、Nitsch、Miller、SH等，它们的配方如下。

表3-1-2常用培养基配方 （单位：mg/L）

五、几种常用培养基的特点

目前，国际上流行的培养基有几十种，常用的培养基及特点如下。

1. MS培养基：MS培养基是目前普遍使用的培养基。它是1962年由Murashige和Skoog为培养烟草细胞而设计的。特点是无机盐离子浓度较高，为较稳定的平衡溶液。其养分的数量和比例较合适，可满足多数植物的营养和生理需要。其硝酸盐含量较其他培养基高，广泛地用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养，效果良好。有些培养基是由它演变而来的。

2. B5培养基：1968年由Gamborg等为培养大豆根细胞而设计。其主要特点是含有较低的铵，这可能是因为铵对不少培养物的生长有抑制作用。从实践得知，有些植物在B5培养基上生长更适宜，如双子叶植物，特别是木本植物。

3. White培养基：1943年由White为培养番茄根尖而设计。1963年又作了改良，称作White改良培养基，提高了MgSO4的浓度，增加了硼素。其特点是无机盐含量较低，适于生根培养。

4. N6培养基：1974年由朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计。其特点是成分较简单，KNO3和（NH4）2SO4含量高。在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花药培养和其他组织培养。

5. SH培养基：1972年由Schenk和Hidebrandt设计。其主要特点与B5培养基相似，不用（NH4）2SO4，而改用NH4H2PO4，是矿质盐浓度较高的培养基。在很多双子叶植物和单子叶植物上使用效果很好。

6. Miller培养基：与MS培养基比较，无机盐用量减少1/3~1/2，微量元素种类减少，无肌醇。