核酸酶是所有可以水解核酸的酶的总称。核酸酶催化的反应是使磷酸二酯键水解，故核酸酶都是磷酸二酯酶。依据核酸酶底物的不同可以将其分为DNA酶（deoxyribonuclease，DNase）和RNA酶（ribonuclease，RNase）两大类。DNA酶只能专一地作用于DNA，RNA酶只能专一地作用于RNA。

根据核酸酶作用的位置不同，可将核酸酶分为核酸外切酶（exonuclease）和核酸内切酶（endonuclease）。核酸外切酶水解位于核酸分子末端的磷酸二酯键，从3′端开始逐个水解磷酸二酯键的核酸外切酶，称为3′→5′外切酶；从5′端开始逐个水解磷酸二酯键的核酸外切酶，称为5′→3′外切酶。核酸内切酶催化水解的是核酸内部的磷酸二酯键。有些核酸内切酶，能专一性地识别并水解特异的核酸序列，称为限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）。一般而言，限制性核酸内切酶识别的特异核酸序列具有回文结构，长4～8bp（详见第十八章）。

细胞内的核酸酶一方面参与DNA的合成与修复及RNA合成后的剪接等重要的基因复制和基因表达过程；另一方面负责清除多余的、结构和功能异常的核酸，同时也可以清除侵入细胞的外源性核酸。这些作用对于维持细胞的正常活动具有重要意义。核酸酶可以分泌到细胞外，例如在人体消化液中核酸酶可以降解食物中的核酸以利吸收。特别是限制性内切酶，由于它能特异性地识别酶切位点，已经成为分子生物学中的重要工具酶。目前已发现的限制性内切酶约有3千种。

有些核酸酶属于多功能酶。例如，有些DNA聚合酶同时具有核酸外切酶活性，在DNA复制过程中可以切除错配的碱基，保证DNA生物合成的精确性。