体内数以千计的蛋白质是混合存在的，要分析某一种蛋白质的结构和功能就必须先将其分离出来，并且在分离过程中一般要求不能破坏蛋白质空间构象。因此，蛋白质分离通常依据其特殊的理化性能，采取透析、盐析、电泳、层析及超速离心等物理方法，获得高度纯化的单一蛋白质。

将蛋白质溶液放入具有超小微孔的半透膜制作的透析袋内，置于水或适当的缓冲液中，小分子杂质（如硫酸铵、氯化钠等）顺浓度差从袋内经微孔扩散到袋外，而大分子的蛋白质被截留在袋内而得到纯化，这种处理称为透析（dialysis）。透析完成后，如果再在袋外放吸水剂如聚乙二醇，则袋内水分也会透出袋外，还可达到浓缩蛋白质的目的。

应用正压或离心力使蛋白质溶液中的水和小分子化合物快速透过含超小微孔的超滤膜，达到浓缩并纯化蛋白质的目的，称为超滤法。此法简便、快速且回收率高，是蛋白质溶液浓缩的常用方法。

蛋白质分子聚集，从溶液中析出的现象称为蛋白质沉淀。通过沉淀可浓缩或分离溶液中的蛋白质。较常用的沉淀蛋白质的方法有盐析（salt precipitation）和有机溶剂沉淀法。

将高浓度的中性盐加入蛋白质溶液中，以破坏蛋白质水化膜并中和其表面电荷，从而导致蛋白质在水溶液中的稳定性因素去除而沉淀。盐析常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等，以硫酸铵最为常用。盐析的原理是在高浓度的中性盐溶液中，由于解离的盐离子亲水性比蛋白质强，与蛋白质亲水胶体争夺与水分子结合，而破坏蛋白质的水化膜，同时盐离子通过异性相吸中和蛋白质表面电离基团的电荷，而减少蛋白质表面电荷。盐析过程中蛋白质的天然构象一般不受影响，即蛋白质不会变性。各种蛋白质盐析时所需的盐浓度不同。例如，血清中的清蛋白及球蛋白，前者溶于pH 7.0左右的半饱和的硫酸铵溶液中，而后者在此溶液中沉淀。当硫酸铵溶液达到饱和时，清蛋白也随之析出。因此，盐析法可将蛋白质初步分离，以便后续的进一步纯化。

丙酮、乙醇和甲醇等极性强的有机溶剂是蛋白质的脱水剂，能破坏蛋白质的水化膜而使蛋白质沉淀。其中以丙酮最常用，用量一般10倍于蛋白质溶液体积。在等电点时沉淀蛋白质的效果更好。不过这种方法在常温下操作会引起蛋白质变性，因此应在0～4℃低温条件下进行，并且沉淀出的蛋白质应尽快与有机溶剂分离。

当溶液pH偏离蛋白质等电点时，带电荷的蛋白质分子在电场中向与其所带电荷相反的电极移动，这种现象称为电泳（electrophoresis）。由于各种蛋白质的等电点不同，在同一pH的溶液中所带电荷的性质和数量也就各不相同，再加上蛋白质的大小、形状等因素的影响，故在同一电场中移动的方向与速度均可不同。利用这一性质可以对蛋白质进行分离与分析。

根据支撑物的不同，电泳可分为醋酸纤维素薄膜电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳等。最常用聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）分离和分析蛋白质，该种凝胶具有分子筛效应，除了按蛋白质所带电荷的多少分离外，还根据不同分子量的蛋白质通过凝胶的微孔所受的阻力不同而分离蛋白质，因此其分辨力很高。

蛋白质溶液（流动相）经过一种固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，将待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的，称为层析（chromatography）。层析是分离纯化蛋白质常用的方法。层析种类很多，有离子交换层析、凝胶过滤和亲和层析等。其中离子交换层析应用最广，其纯化效果好。

离子交换层析是用离子交换剂填充的层析柱来分离蛋白质。离子交换剂的种类很多，目前常用的是带正电荷的阴离子交换纤维素或树脂颗粒。先调节待分离蛋白质溶液的pH，使之大于蛋白质等电点。这将使带负电荷的蛋白质在层析柱中与带正电荷的阴离子交换剂结合。然后，用含阴离子（如Cl ^-）的溶液洗柱。带负电荷少的蛋白质首先被洗脱下来，再增加Cl ^-浓度，带负电荷多的蛋白质也被洗脱下来，这样两种蛋白质就被分离了（图1-21）。

凝胶过滤又称分子筛层析。层析柱内填满带有小孔的凝胶颗粒，一般由葡聚糖制成。蛋白质溶液在流经层析柱过程中，小分子蛋白质进入孔内，因而在柱中滞留时间较长，大分子蛋白质不能进入孔内而径直先流出，这样就使不同大小的蛋白质得以分离（图1-22）。此方法要求待分离蛋白质的分子量彼此之间相差要大。分离效果不及离子交换层析。

超速离心法是利用超速离心机产生的高达50万g（g为gravity，即地心引力）的强大离心力，使不同密度的蛋白质在离心管的溶液中沉降的位置不同，而分离不同的蛋白质。蛋白质颗粒在单位离心力作用下沉降的速度用沉降系数（sedimentation coefficient，S）表示，系数与蛋白质的密度和形状有关。

式中x为沉降距离，t为离心时间，ω为离心角速度。沉降系数用Svedberg单位代表（1S=1×10 ^-13秒）。

沉降系数大体上和分子量成正比，应用超速离心法测定蛋白质分子量时，一般用一个已知分子量的标准蛋白质作为参照，计算公式如下：

这一公式对大多数球状蛋白质适用，但对大多数纤维状蛋白质不适用，因为其形状的高度不对称。

具有功能的蛋白质是由其特定的空间结构决定的，而特定的空间结构特别是其所含的三级结构是以氨基酸顺序为基础的，因此对蛋白质一级结构进行氨基酸测序是研究蛋白质构象和功能不可或缺的前提。

肽链末端分析法是确定肽链末端氨基酸的方法。此方法是由英国F. Sanger开创的，并于1953年完成了第一个蛋白质的测序，即胰岛素的氨基酸顺序测定。现在，此方法已有很大改进并与自动化分析仪器结合，已有数百种蛋白质的氨基酸序列通过此方法确定。该方法的主要步骤包括：①用多种水解法分别将同一种多肽链水解成片段，然后分离纯化各个肽段。由于不同的水解法水解的肽键部位不同，因而切点互相错开。②对每一个肽段的末端进行氨基酸分析，用有色物质（如Sanger当年用二硝基氟苯）或荧光物质（如现在用的丹酰氯）来标记肽链的N-端和（或） C-端的氨基酸，标记后将肽链末端氨基酸水解下来，再鉴定带标记物的氨基酸是何种氨基酸。③将肽段进行拼接、对比，即可确定氨基酸的排列顺序。下面选用二硝基氟苯-氨基末端分析法测定十肽的简单例子加以说明。

一种十肽经胰蛋白酶（特异地水解lys和Arg的羧基形成的肽键）水解得到数个小肽段；再将十肽用酸部分水解，随机切断得到另一套小肽。分离纯化后，用二硝基氟苯分别与每一个肽段的N-端α-氨基结合生成二硝基苯肽，再将肽段水解成氨基酸，然后鉴定标记有二硝基苯的氨基酸种类（以*标示），同时分析肽段所有的氨基酸数量和种类（图1-23）。

最后进行拼接、对比，确定十肽的氨基酸的排列顺序：

胰蛋白酶水解：*谷—赖 *甘—甘—赖 *组—赖 *苏—甘—脯

酸部分水解：*谷—赖—甘 *甘—赖—组 *苏—甘 *赖—甘—甘 *组—赖—苏

拼接确定顺序：谷—赖—甘—甘—赖—组—赖—苏—甘—脯

肽链末端分析法的实际工作是相当复杂的，仅含51个氨基酸残基的胰岛素测序也是F. Sanger等人通过多年的努力才得以完成。

此法由P. Edman创立，从小肽段的N端开始逐个分解、鉴定氨基酸种类。其原理是将异硫氰酸苯酯与肽段N-端α-氨基结合生成苯氨基硫甲酰肽，然后用稀酸处理，使N-端的苯氨基硫甲酰-氨基酸环化生成苯乙内酰硫脲衍生物而从肽段上脱下，再用层析质谱法鉴定是何种氨基酸的衍生物（图1-24）；留下的肽段又可重复上述过程依次逐个测定，故称为顺序递减法。此法可连续测定含20多个氨基酸残基的肽段，因此分析速度大大提高，但要分析更长的多肽链顺序，则与肽链末端分析法策略一样，必须采用分段水解、拼接、对比，才能最终确定整条多肽链的氨基酸顺序。

近几十年来对于核酸的研究无论在理论上还是技术上的进展都非常迅猛，也包括核酸测序研究，现在核酸测序速度远超过了氨基酸顺序分析的速度。因此，可通过测定编码蛋白质的基因的DNA序列，排列出mRNA序列，再按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列，称为核酸推演法。目前，多数蛋白质的氨基酸序列都是通过此法获得的。

研究蛋白质在机体内存在的空间结构，对于认识蛋白质的功能以及如何执行功能的内在关系至关重要。由于蛋白质的空间结构十分复杂，因而其测定的难度也较大。随着测定空间结构的技术和理论发展，目前对蛋白质的空间结构研究已普遍开展。测定的主要手段是X射线衍射法（X-ray diffraction）、磁共振技术（nuclear magnetic resonance，NMR）和圆二色光谱（circular dichroism，CD）。

通常采用CD测定溶液状态下的蛋白质二级结构。α-螺旋的CD峰有222nm处的负峰、208nm处的负峰和198nm处的正峰3个成分；而β-折叠的CD谱不很固定。因而测定含α-螺旋较多的蛋白质更准确。

X射线衍射法是研究蛋白质三级空间结构最准确、最常用的方法，目前为止有80%的蛋白质空间结构是由该方法测得的。其原理是将蛋白质制备成晶体，X射线射至蛋白质晶体上，可产生不同方向的衍射，用X光片接受衍射光束，形成衍射图。然后，借助计算机测定和计算衍射图上的衍射斑的位置和密度，就可确定蛋白质晶体的三维结构。X射线衍射法有其局限性，一些蛋白质无法制备成能满足三维结构分析的晶体；另外，所获得的是固体结晶状态的空间结构，这与蛋白质在体内的天然状态可能有所不同。

NMR是研究蛋白质三级空间结构最准确的方法，目前应用越来越多。其原理是通过磁共振，使蛋白质分子中原子的电子云与外加磁场相互作用产生化学位移，以及使原子核产生自旋耦合，通过测定化学位移和自旋耦合的大小可确定原子在分子中的位置和性状，从而获得三维结构。NMR最突出的优点是能够在溶液环境下测定大分子蛋白质的空间结构，所获得的空间结构更接近蛋白质的天然状态。

根据蛋白质的氨基酸序列预测其三级结构，近年来这方面研究受到关注。目前最常用的预测方法是同源模建和折叠识别。

同源模建是先在蛋白质结构数据库中寻找与未知结构蛋白质同源的蛋白质，再借助计算机将未知结构蛋白的序列与已知结构的同源蛋白序列比较，调整氨基酸残基（替换、插入或缺失氨基酸残基），通过优化计算构建出目标蛋白质的三级结构。已知结构的同源蛋白与未知结构的蛋白质同源性越高，则预测的三级结构可靠性也越高。

折叠识别是将一条多肽链分段与各种已知二级结构的序列比较，计算出各段序列可能折叠形成的二级结构，再参考其他蛋白质的空间结构，从而产生目标序列的三维结构。