第三节 免疫标记技术
免疫标记技术是将抗原抗体反应与标记技术相结合，用标记物标记已知抗原或抗体，通过检测标记物间接测定抗原抗体复合物的一种技术。常用标记物包括酶、荧光物质、胶体金、化学发光剂、放射性核素等。免疫标记技术极大地提高了检测灵敏度，能对抗原或抗体进行定性和精确定量测定。
一、酶免疫技术
酶免疫技术是以酶作为标记物，将酶高效催化反应的专一性和抗原抗体反应的特异性相结合的一种常用免疫标记技术。将酶与抗体或抗原结合成酶标记抗原或抗体，在酶标记抗体（抗原）与待测抗原（抗体）的特异性反应完成后，加入酶作用的相应底物，通过酶催化底物产生显色反应，对抗原或抗体进行定位、定性或定量测定。
（一）酶联免疫吸附试验
1.原理
酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）的原理是将抗原或抗体结合至某种固相载体表面，再将抗体或抗原与酶连接成酶标记抗体或抗原。测定时，将待测标本（含待测抗原或抗体）和酶标记抗体或抗原按一定程序与结合在固相载体上的抗原或抗体反应，形成固相抗原抗体-酶复合物；用洗涤的方法将固相载体上形成的抗原抗体-酶复合物与其他成分分离，结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定比例；加入底物后，底物被固相载体上的酶催化生成有色产物，根据显色反应程度对标本中的抗原或抗体进行定性或定量分析。
ELISA常用的固相载体是聚苯乙烯塑料制成的微量反应板，常用的酶是辣根过氧化物酶（HRP）。HRP最常用的底物为四甲基联苯胺（TMB），TMB经HRP作用后呈蓝色，加入硫酸终止反应后变为黄色，最大吸收峰波长为450nm。
根据其检测抗原和抗体的不同，采取不同的ELISA测定方法。在测定抗原时，蛋白大分子抗原检测大多采用双抗体夹心法，而对于只有单个抗原决定簇的小分子抗原，则采用抗原竞争法。测定抗体通常采用间接法、双抗原夹心法、抗体竞争法、捕获法等，其中捕获法常用于检测IgM型抗体。
2.应用
ELISA广泛应用于多种传染病的实验室诊断，在病毒学检测中常应用于病毒性肝炎（甲肝抗体、“乙肝三对”、丙肝抗体、丁肝抗体、戊肝抗体）、风疹病毒、疱疹病毒、轮状病毒测定；在细菌检测中常应用于结核分枝杆菌、幽门螺杆菌等的测定。ELISA也可用于蛋白检测，例如：各种免疫球蛋白、补体、细胞因子、肿瘤标志物（甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺特异性抗原等）等。
（二）斑点酶免疫吸附试验
1.原理
斑点酶免疫吸附试验（dot-ELISA）的实验原理与常规ELISA相同，不同之处在于dot-ELISA所用载体为对蛋白质具有较强吸附力的硝酸纤维素（NC）膜，酶作用于底物后形成有色沉淀物，使硝酸纤维素膜染色。
2.应用
灵敏度较ELISA高6～8倍，试剂用量少、不需特殊设备，实验结果可以长期保存，但操作较烦琐。常用于各种蛋白质、激素、药物和抗生素的定量测定。
（三）免疫印迹试验
1.原理
免疫印迹试验（immunoblot test，IBT）亦称酶联免疫电转移印迹法（enzyme linked immunoelectrotrasfer blot，EITB）或Western blot，是将蛋白质电泳分离与酶免疫测定相结合形成的蛋白检测技术。
免疫印迹法分为三个基本步骤：①十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。抗原等蛋白样品经SDS处理后带负电荷，从负极向正极泳动，分子量越小，泳动速度越快，将蛋白质按分子质量大小和所带电荷多少进行分离，此时分离效果肉眼不可见。②电转移。将在凝胶中已经分离的条带转移到硝酸纤维素膜上，此时肉眼仍不能观察到蛋白质分离条带。③酶免疫定位测定。将带有蛋白条带的硝酸纤维素膜依次与特异性抗体、酶标记抗体反应后，加入反应底物使区带染色。常用的HRP底物为3，3-二氨基联苯胺（呈棕色）、4-氯-1-萘酚（呈蓝紫色），阳性反应条带清晰可辨，并可根据电泳时加入的分子量标准，确定各组分的分子量。
2.应用
免疫印迹法综合了SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特异性和敏感性，广泛应用于分析抗原组分及其免疫活性，并可用于疾病诊断。此法已用于艾滋病病毒感染的确诊试验。
（四）生物素-亲和素系统酶联免疫吸附试验
1.原理
生物素-亲和素系统（biotin avidin system，BAS）酶联免疫吸附试验（biotin avidin system-ELISA，BAS-ELISA），是BAS与ELISA的组合应用技术。生物素与亲和素的结合具有很强的特异性，其结合力远远超过抗原抗体反应，且结合后极稳定。1个亲和素分子可与4个生物素分子结合形成一种类似晶体的复合体，且具有多级放大作用，可极大提高检测方法的灵敏度。BAS-ELISA可分为桥联亲和素-生物素法（BAB法）、酶标记亲和素-生物素法（BA法）两种类型。BAB法是以游离的亲和素分别桥联生物素化抗体和生物素化酶的检测方法，BA法是直接以酶标亲和素联结生物素化抗体以检测抗原的方法。
2.应用
BAS-ELISA灵敏度高、特异性高、稳定性高，但操作步骤较多。可用于检测可溶性抗原及其相应抗体，例如：链球菌、肺炎链球菌、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒等及其抗体。
（五）酶免疫组织化学技术
1.原理
在一定条件下，应用酶标记抗体（抗原）与组织或细胞标本中的抗原（抗体）发生反应，催化底物产生显色反应，通过显微镜观察标本中抗原（抗体）的定位、分布和性质，也可通过图像分析技术达到定量的目的。酶免疫组织化学技术（enzyme labeled immunohistochemical method）中最常用的酶是辣根过氧化物酶，常用底物包括二氨基联苯胺（DAB），反应产物呈棕色；氨基乙基卡巴唑（AEC），反应产物呈橘红色；4-氯-1-萘酚，反应产物为灰蓝色。
2.应用
酶免疫组织化学技术可提高病理诊断准确性，可对癌基因蛋白进行定位和定量检测，可对肿瘤细胞增生抗原进行定位、定量，以判断肿瘤增生程度，有助于发现微小转移灶、临床判断肿瘤是原位还是有浸润发生以及有无血管、淋巴转移，还可用于指导肿瘤靶向治疗等。
二、荧光免疫技术
荧光免疫技术是以荧光物质作为标记物，将抗原抗体反应与荧光技术相结合的一种免疫标记技术，是最早出现的免疫标记技术。常用的荧光物质包括异硫氰酸荧光素（FITC）、四乙基罗丹明（RB200）、藻红蛋白（PE）、镧系螯合物铕（Eu3+）、荧光底物等。
（一）荧光显微镜技术
1.原理
荧光显微镜技术又称荧光抗体技术（fluorescence antibody technique，FAT），采用荧光物质标记抗体与标本片中组织或细胞抗原反应，经洗涤分离后，在荧光显微镜下观察呈特异性荧光的抗原抗体复合物及其部位，借此对组织细胞抗原进行定性和定位检测、对自身抗体进行定性和效价测定。
2.应用
常用于检测病原体、自身抗体、细胞表面抗原和受体等。
（二）流式细胞术
1.原理
流式细胞术（flow cytometry， FCM）需采用流式细胞仪进行检测分析。流式细胞仪由液流系统、光学与信号转换测试系统、信号处理及放大的计算机系统三大基本结构组成，采用激光作为激发光源，利用荧光染料与单克隆抗体相结合的标记技术，借助计算机系统对流动的细胞悬液中的单个细胞或特定细胞或其超微结构进行多参数快速分析。
2.应用
可用于淋巴细胞及其亚群分析、免疫细胞分选及功能分析、细胞分化抗原及白血病免疫分型、肿瘤耐药相关蛋白分析以及艾滋病检测、移植免疫和自身免疫性疾病等相关人类白细胞抗原分析，应用范围非常广泛。
（三）时间分辨荧光免疫测定
1.原理
时间分辨荧光免疫测定（time resolved fluorescence immunoassay，TRFIA）的原理是以镧系螯合物标记抗体、抗原、激素、多肽、蛋白质、核酸探针及生物细胞，待反应体系发生后，用时间分辨荧光免疫检测仪测定反应产物中的荧光强度，根据产物荧光强度和相对荧光强度的比值，判断反应体系中分析物浓度，从而进行定量分析。
2.应用
灵敏度高、分析范围广、标记结合物稳定、有效期长、测量快速、易于自动化、无放射性污染，适用于体液中极微量生物活性物质的定量检测，可用于蛋白质、激素（肽类激素、甲状腺激素、类固醇激素等）、药物、肿瘤标记物、病原体抗原或抗体等检测。
（四）荧光偏振免疫测定
1.原理
荧光偏振免疫测定（fluorescence polarization immunoassay， FPIA）常用异硫氰酸荧光素（FITC）标记小分子抗原，利用抗原抗体竞争反应原理，根据荧光素标记抗原与荧光素抗原抗体复合物之间荧光偏振强度的差异，测定体液中小分子抗原物质含量。在反应体系中，荧光素标记的小分子抗原（AgF）转动速度快、偏振荧光弱；与抗体结合后，荧光素标记抗原抗体复合物（AgF-Ab）分子增大、转动速度减慢，受偏振光激发后发射出的偏振荧光明显增强。当待检抗原浓度增高时，由于竞争性结合导致形成AgF-Ab减少，游离AgF较多，受偏振荧光激发后发射出的偏振荧光弱，即待检抗原含量与偏振荧光强度呈负相关，通过标准曲线即可推算出待检抗原含量。
2.应用
样品用量少、荧光素标记结合物稳定、方法重复性好、快速、易于自动化，但仪器设备昂贵、药品试剂盒专属性强、灵敏度稍低，常用于血清或尿液中小分子抗原物质（特别是药物浓度）的测定，不适用于大分子物质测定。目前已有数十种药物（例如：环孢素、卡马西平、苯妥英钠、丙戊酸、地高辛、氨茶碱、苯巴比妥等）、维生素、激素、毒品等使用此方法进行定量检测。
（五）荧光酶免疫测定
1.原理
荧光酶免疫测定（fluorescent-enzyme immunoassay， FEIA）的原理是利用酶标记抗体（或抗原）与待检抗原（或抗体）反应，借助酶催化荧光底物，经酶促反应生成稳定而高效的荧光物质，通过测定荧光强度确定待检抗原或抗体的含量。采用碱性磷酸酶（ALP）标记抗体（或抗原），以4-甲基伞形酮磷酸盐（4-MUP）为ALP反应荧光底物；ALP分解4-MUP脱磷酸根基团后形成4-甲基伞形酮（4-MU），4-MU经360nm激发光照射发出450nm的荧光，通过荧光检测仪测定荧光强度，并推算出待检抗原或抗体含量。
2.应用
灵敏度较高、标记物稳定、有效期长、操作简单，但荧光测定时应考虑血清和其他生物样品背景荧光的干扰。可用于多种抗原抗体的检测，例如：细菌及毒素抗原、病毒抗体、激素、肿瘤标志物、过敏原、凝血因子等。
三、胶体金免疫技术
胶体金免疫技术是以胶体金作为示踪标记物或显色剂，应用于抗原抗体反应的一种免疫标记技术，主要有胶体金免疫测定技术、胶体金免疫组织化学技术。由于胶体金有不同大小的颗粒，且电子密度高，故胶体金免疫技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。由于胶体金本身呈淡至深红色，因此也适合进行光镜观察。
（一）胶体金免疫测定技术
胶体金免疫测定技术主要包括斑点金免疫渗滤试验（dot immunogold filtration assay，DIGFA）、斑点金免疫层析试验（dot immunogold chromatographic assay，DICA）。
1.原理
（1）斑点金免疫渗滤试验 在以硝酸纤维素膜为载体并包被了抗原或抗体的渗滤装置中，依次滴加标本、免疫金、洗涤液。因微孔滤膜贴置于吸水材料上，故溶液流经渗滤装置时与膜上的抗原或抗体快速结合并起到浓缩作用，达到快速检测目的。阳性反应在膜上呈现红色斑点。
（2）斑点金免疫层析试验 将胶体金标记技术和蛋白质层析技术相结合、以硝酸纤维素膜为载体的快速固相酶免疫分析技术。滴加在膜一端的标本溶液受载体膜的毛细管作用向另一端移动，犹如色谱一般，在移动过程中待检物与固定于载体膜上某一区域的抗体或抗原结合而被固相化，无关物则越过该区域而被分离，然后通过胶体金的呈色条带进行结果判读。
2.应用
不能准确定量，只能作为定性或半定量试验。目前主要限于检测正常体液中不存在的物质，以及正常含量极低而在特殊情况下异常升高的物质，例如：传染病病原体抗原及抗体、毒品类药物、激素和某些肿瘤标志物。
（二）胶体金免疫组织化学技术
1.原理
胶体金是指由直径1～100nm的金颗粒所组成的分散系，即金以或大或小的微小粒子分散在另一种物质中所形成的体系。通常所说的胶体金是指以微小的粒子分散在水中所形成的金溶胶，其颜色与粒子大小有关，例如：15nm的胶体金为红色、95nm的胶体金则为蓝色。一般用于免疫组织化学的胶体金颗粒直径范围5～60nm，均呈红色，颗粒越小，红色越深。胶体金可在相当长的时间内保持溶胶不变，其稳定性受多种因素影响，最主要的是电解质，其次还与浓度、温度等有关。胶体金制备应用最多的是化学还原法，在氯金酸水溶液中加入一定量还原剂，使金离子还原为金原子。常用的还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、白磷。其中，柠檬酸钠还原制备的金颗粒直径较大，为15～150nm；白磷还原制备的金颗粒直径较小，为3～12nm。
胶体金作为金的水溶胶，能迅速稳定吸附蛋白，对蛋白的生物学活性无明显影响。因此，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子（如葡萄球菌A蛋白等）作为探针，就能对组织或细胞内抗原进行定性、定位甚至定量研究。
2.应用
（1）免疫金法（immunogold staining，IGS）
①直接法：将胶体金标记的一抗直接对标本进行染色，然后在光镜或电镜下进行观察。方法非常简单，但由于一种探针只能研究一种抗原，所以比较受局限。用胶体金标记的单克隆探针，进行双重或多重染色效果比较好。
②间接法：先将未标记的特异性一抗与标本中的抗原结合，然后用金标二抗与一抗结合，在光镜或电镜下对抗原分布进行定位研究。一般多采用间接法。
（2）免疫金-银染色法（immunogold sliver staining，IGSS）
①原理：是1983年Holgate等人将IGS与银显影方法相结合建立的方法。金颗粒标记抗原（或抗体）与相应抗体（或抗原）特异性结合后，形成金标记免疫复合物；在银显色剂作用下，标记物上的金颗粒起液化作用，用对苯二酚还原剂使显影液中的硝酸银离子还原成银原子沉淀，被还原的银原子在抗原抗体复合物的金颗粒周围形成一个逐步增大的黑色“银壳”。由于金颗粒的液化催化作用，且“银壳”一旦形成本身也具有催化作用，因此更多的银离子被还原，最后使“银壳”显示的抗原位置清楚扩大，从而提高镜下可见度。
②应用：操作简单、特异性强、敏感性高，光镜、扫描电镜、透射电镜等均能检测，特别适用于检测微量抗原及石蜡切片标本中的微弱抗原。
（3）免疫金-银染色双PAG法
①原理：葡萄球菌A蛋白（SPA）与许多哺乳动物IgG具有亲和性，且两者连接不干扰抗原抗体结合。简单的SPA金标记二步法后，第三步用抗SPA与SPA金表面分子通过Fab或Fc段相结合，可结合更多胶体金颗粒，再通过银增强，可使原始信号得到几何级放大。
②应用：较免疫金-银染色法敏感性提高5～8倍，使用试剂单一、第一抗体用量少，减少了非特异性染色，更适用于检测抗原性较弱或抗原丢失严重的组织细胞。
四、化学发光免疫分析技术
（一）原理
1.直接化学发光免疫分析
以化学发光剂（如吖啶酯）直接标记抗原（或抗体），与待测标本中相应的抗体（或抗原）发生反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-标记抗体复合物。加入氧化剂（H2O2）和碱性溶液（NaOH）使反应系统呈碱性，则发光剂发光，通过检测发光强度可进行定性或定量分析。
2.化学发光酶免疫分析
以参与催化某一化学发光反应的酶标记抗体或抗原，与待测标本中相应抗原或抗体发生反应后，形成固相抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物；经洗涤后加入发光底物，酶催化和分解底物发光，通过测定发光信号可对待测抗原或抗体进行定量分析。
3.电化学发光免疫分析
以电化学发光剂三联吡啶钌标记抗原或抗体，以磁性微粒作为固相载体。常用双抗体夹心法，待测标本与相应已知抗体结合，形成磁性微粒包被抗体-待测抗原-三联吡啶钌标记抗体复合物，启动电化学发光，光强度与待测抗原浓度成正比。
4.鲁米诺氧途径免疫分析
鲁米诺氧途径免疫分析技术使用的是均相化学发光检测技术。参与反应的一个抗体包被感光珠，内含酞菁；另一个抗体包被发光珠，内含二甲基噻吩衍生物及Eu螯合物。在目标抗原存在的情况下，可形成双抗体夹心免疫复合物，目标抗体可使两个抗体上标记的感光珠和发光珠紧密连接在一起。感光珠在波长680nm激发光照射下，使周围氧分子激发变成单线态氧，单线态氧扩散至发光珠并传递能量；发光珠发射520～620nm荧光信号并被单光子计数器检测。单线态氧在反应体系中只能扩散大约200nm，因此，只有结合态发光珠才能获得单线态氧的能量并发光；非结合态发光珠由于距离较远，无法获得能量而不发光。
（二）应用
化学发光免疫分析技术标记物为非放射性物质，操作实现了自动化，具有快速、简便、灵敏度高、特异性强、标记物稳定、试剂有效期长等特点，已广泛应用于各种激素、肿瘤标志物、心脏标志物、感染性疾病、治疗药物等各种抗原、抗体和半抗原的检测。
五、放射免疫技术
放射免疫技术是以放射性核素作为标记物的一种免疫标记技术，用于定量检测受检标本中的微量物质。最常用的放射性核素是125I，用γ计数器测定其放射性。根据放射性核素标记对象不同和检测方法不同，可分为放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA）、免疫放射分析（immunoradiometric assay，IRMA）。
（一）原理
1.放射免疫分析
用放射性核素标记抗原（Ag*），使其与待检标本中的抗原（Ag）竞争结合限量的特异性抗体（Ab），并形成可溶性抗原抗体复合物Ag-Ab和Ag*-Ab，直至达到平衡状态。若Ag量多，则形成的Ag-Ab多，Ag*-Ab复合物（B）就少，游离的Ag*（F）多，即待测Ag量与Ag*-Ab复合物（B）成反比关系，与游离的Ag*（F）成正比关系。用已知不同浓度的抗原标准品得到相应B和F值，绘制标准曲线，待测标本在相同条件下进行反应，可在标准曲线上分析待测标本中抗原量。
2.免疫放射分析
以双抗体夹心法最为常用，是用放射性核素标记特异性抗体。测定时待测抗原先与过量的固相抗体反应，形成固相抗体-待测抗原复合物于固相载体表面；洗涤除去未结合物质，再加标记抗体，形成固相抗体-待测抗原-标记抗体复合物，未结合的标记抗体通过洗涤去除。用已知抗原浓度的系列标准品进行反应获取标准曲线，将待测标本进行相同条件反应，即可从标准曲线上分析标本中抗原浓度。
（二）应用
灵敏度高、特异性强、重复性好，可用于激素、维生素、药物、肿瘤标志物、病原体抗原或抗体的定量分析。但存在放射性污染、试剂盒有效期短、检测设备特殊等缺陷，正面临逐渐被其他免疫标记技术取代的趋势。