第二节 沉淀反应
一、免疫浊度测定
（一）原理
可溶性抗原与相应抗体在特定电解质溶液中反应，通过增浊剂（聚乙二醇等）作用可迅速形成免疫复合物微粒，使反应液出现浊度。在抗体稍过量且固定的情况下，形成的免疫复合物量随抗原量的增加而增加，反应液浊度亦随之增大，即待测抗原量与反应液浊度呈正相关，可计算出标本中待测抗原含量。现使用自动化免疫浊度分析仪进行检测，根据检测器的位置及其所检测光信号性质不同，可分为免疫透射比浊法、免疫散射比浊法、胶乳增强免疫比浊法。
1.免疫透射比浊法
可溶性抗原与相应抗体结合形成复合物，使反应液介质浓度发生改变；光线通过反应液时，被其中的免疫复合物微粒吸收。在保持抗体过量的情况下，吸光度与免疫复合物量成正比。通过与标准曲线比较，即可确定标本中待测抗原含量。
2.免疫散射比浊法
抗原、抗体在液相中特异性结合后产生一定大小的免疫复合物，当一定波长的光通过该溶液遇到免疫复合物时光线发生散射现象，散射光的强度与免疫复合物的含量和散射夹角成正比，与入射光波长成反比。当散射夹角和入射光波长一定时，散射光的强度与免疫复合物量成正比；而当反应体系保持抗体过剩时，形成的免疫复合物量又与抗原成正比，通过检测散射光强度可计算出待测抗原含量。根据散射光检测时间及检测方式的不同，分为定时散射比浊法、速率散射比浊法，后者最常用。
（1）定时散射比浊法 在保证抗体过量的情况下，加入待测抗原，此时反应立即开始。在反应的第一阶段，溶液中产生的散射光信号波动较大，据此获取的信号经计算所得结果会产生一定误差。定时散射比浊法避开抗原抗体反应的不稳定阶段（散射光信号在开始反应7.5～120s内的第一次读数），而在抗原抗体反应的最佳时段进行读数，可将检测误差降到最低。
（2）速率散射比浊法 是抗原抗体结合反应的动力学测定法。所谓速率，是指抗原抗体反应在单位时间内形成免疫复合物的量（不是免疫复合物累积的量）。连续测定各单位时间内复合物形成的速率，分析与其产生散射光信号之间的关系，形成动态速率散射比浊法，每项检测1～2min即可完成。
抗原与抗体混合后的瞬间便引发反应，在抗体过量的前提下，抗原抗体反应速度由慢至快，单位时间内形成的免疫复合物不断增多，随后逐渐减慢。连续动态监测此过程，可发现在某一时间段内抗原抗体反应速率最快，单位时间内免疫复合物形成量最多，散射光强度变化最大，即为速率峰。随着抗原抗体反应时间的延长，免疫复合物总量逐渐增加，而速率的变化则由慢到快再由快逐渐变慢，在20～25s这个单位时间内抗原抗体反应的速率达到高峰，即出现速率峰，该峰值大小与抗原浓度呈正相关。选取速率最大，且与被测物浓度变化呈线性关系的速率峰值，制作剂量-反应曲线，通过计算机运算即可获得被测物浓度。
3.胶乳增强免疫比浊法
将抗体吸附在大小适中、均匀一致的胶乳颗粒上，在遇到相应抗原时，胶乳颗粒上的抗体与抗原特异结合，引起胶乳颗粒凝聚。分散的单个胶乳颗粒直径位于入射光波长之内，不阻碍光线通过，当两个或两个以上胶乳颗粒凝聚时，透射光和散射光即出现显著变化。采用透射比浊法或散射比浊法测定抗原抗体反应后溶液的吸光度或散射光强度与待测抗原浓度呈正相关。
（二）应用
免疫浊度测定方法灵敏度高、快速、简便、易于自动化，已广泛应用于临床各种微量物质的定量检测。主要用于检测血液、尿液等标本中特定蛋白质及药物浓度，例如：IgG、IgM、IgA、C3、C4、超敏C反应蛋白等。
二、免疫电泳技术
（一）火箭电泳
1.原理
火箭电泳（rocket electrophoresis）是单向免疫扩散试验与定向加速电泳技术的结合。将抗体混合于琼脂中，电泳时抗原由负极向正极泳动，在抗原、抗体比例适当时形成不溶性免疫复合物沉淀线。泳动过程中随着抗原量的减少，沉淀线越来越窄，最终形成火箭状沉淀峰，峰高度与抗原量呈正相关。
2.应用
火箭电泳只能测定微克每毫升（μg/mL）数量级以上的抗原含量。若加入少量125I标记的标准抗原进行共同电泳，则可在含抗体的琼脂中形成不可见的放射自显影；经X光胶片显影，根据自显影火箭峰高度可计算出抗原浓度。此种与放射免疫自显影技术相结合的火箭电泳可检测纳克每毫升（ng/mL）数量级的抗原浓度。
（二）对流免疫电泳
1.原理
对流免疫电泳（counter immunoelectrophoresis， CIE）是双向免疫扩散试验与定向加速电泳技术的结合。在pH 8.6的琼脂凝胶中，抗体泳向负极，置入正极侧孔；抗原泳向正极，置入负极侧孔。抗原、抗体相对泳动，在两孔间相遇，比例合适时形成肉眼可见的沉淀线。
2.应用
对流免疫电泳可检测微克每毫升（μg/mL）数量级浓度的蛋白质，常用于抗原或抗体性质、效价和纯度测定。此方法不适合于抗原为免疫球蛋白或迁移率接近的抗原、抗体检测，否则会导致抗原、抗体朝同一个方向泳动。
（三）免疫电泳
1.原理
先将蛋白质抗原置入琼脂板内进行区带电泳，不同抗原成分由于所带电荷、分子量及分子构型的不同，被分成不同区带。在与电泳方向平行的侧边开槽，并加入相应的抗血清进行双向扩散，在抗原、抗体比例合适处形成弧形沉淀线。通过对沉淀线数量、位置和形态与已知标准抗原抗体沉淀线比较，可对待测标本中所含成分的种类和性质进行分析。
2.应用
免疫电泳（immunoelectrophoresis，IEP）样品用量少、分辨力强，可用于分析纯化抗原、抗体的成分，进行正常、异常免疫球蛋白的识别与鉴定。
（四）免疫固定电泳
1.原理
免疫固定电泳（immunofixation electrophoresis，IFE）是区带电泳和沉淀反应相结合的免疫化学分析技术。先将血清蛋白质在琼脂糖凝胶介质上经区带电泳分离，再将固定剂和各型免疫球蛋白及轻链抗血清置入凝胶表面的泳道上；经温育后，固定剂和抗血清在凝胶内渗透并扩散，抗原、抗体直接发生沉淀反应。洗脱游离的抗体，抗原抗体复合物则保留在凝胶中，经染色后可对各类免疫球蛋白及其轻链进行分型。
2.应用
免疫固定电泳分辨率强、敏感度高、操作周期短、结果易分析。常用于鉴定迁移率相近的蛋白和M蛋白、免疫球蛋白轻链、尿液及脑脊液等标本中的微量蛋白、游离轻链、补体裂解产物等，最常用于M蛋白的鉴定与分型。
（五）交叉免疫电泳
1.原理
交叉免疫电泳（crossed immunoelectrophoresis，CIEP）是将琼脂平板电泳和火箭电泳相结合的免疫电泳分析技术。先将抗原样品在琼脂凝胶中进行电泳分离，然后使已分开的各抗原成分与原泳动方向呈90°的方向泳向含抗体的琼脂凝胶中，则该抗原样品中的各个抗原成分与相对应的抗体依次形成若干锥形沉淀线，根据沉淀线位置及面积（或高度）可确定该抗原的种类和浓度。
2.应用
交叉免疫电泳分辨率较高，一次可对多种抗原定性定量。适用于比较各种蛋白组分，分析蛋白质遗传多态性、微小异质性、裂解产物和不正常片段等。