1.4　Nano-HA粉体溶血试验

溶血试验是用于评价长期与骨组织或软组织接触的材料的体外急性溶血活性。通过材料与血细胞在体外接触过程中所致红细胞溶解和血红蛋白游离程度的测定，对材料的体外溶血性进行评价。该试验能敏感地反映材料对红细胞的影响，故是一种特别有意义的材料筛选试验。采用YY/T 1532—2017《医疗器械生物学评价纳米材料溶血试验》，通过对不同兔血的反应测定，其平均溶血率为5%。一般来讲，具有毒性物质的材料所造成的溶血反应程度较其在细胞培养中所产生的毒性反应程度大，当在溶血试验中测得有溶血活动时，可提示材料有毒性。

1.4.1　溶血试验方法

进行溶血试验时采用Nano-HAⅠ生理盐水浸提液、Nano-HAⅠ生理盐水混悬液（10mg/mL）、Nano-HAⅡ生理盐水浸提液、Nano-HAⅡ生理盐水混悬液（10mg/mL）4组材料。

穿刺新西兰兔心脏取血20mL，加入1mL 20g/L草酸钾制成新鲜抗凝血，取8mL抗凝血加10mL生理盐水稀释。将试验材料样品分为4组，每组3份，分别加入浸提液10mL，置于37℃水浴中保温30min。阳性对照组为10mL蒸馏水3份，阴性对照组为10mL生理盐水3份。18只试管中均加入0.2mL稀释兔血，混匀后，置于37℃水浴箱中保温60min，1000r/s离心5min，吸取上清液移入比色皿中，用721分光光度计在波长为540nm处测吸光度，根据结果按公式计算溶血度。

1.4.2　溶血试验结果

相关的ISO标准要求试验组中阳性对照组吸光度值应在0.8±0.5范围内，阴性对照组吸光度值应小于0.03，否则不可进行。标准溶血浓度小于5%为不溶血。本试验各试验组溶血率均小于5%，见表1-7。

表1-7　各组Nano-HA溶血程度

按照标准建议的方法，对Nano-HA的溶血活性进行测试，同时考虑到Nano-HA的粒子尺寸大小的特点，有通过毛细血管壁（内径为8～10μm）进入血液循环的可能，测试了10mg/mL混悬液的溶血率，结果均小于5%，故认为不同分散处理Nano-HA材料无溶血反应。