1.3　HA粉体急性毒性检测实验

生物材料的急性毒性试验按GB/T 16886.11—2011进行。一般指机体（实验动物）一次或24h内多次接触外来化合物之后所引起的中毒效应，甚至引起死亡。其途径可包括经口、经皮、经腹腔、经静脉等不同的给予方法，可以从不同角度了解不同处理的HA粉体进入机体后的全身代谢和造成的机体毒性反应，从而评价生物材料的急性毒性作用。

1.3.1　实验材料及方法

选用不同HA粉浸提液和混悬液（浓度为10mg/mL）、普通HA粉末浸提液。实验动物为18～22g健康昆明小鼠（黑动字第99101001号）77只，由佳木斯大学动物中心提供。

将77只小鼠，随机分成11组，分别进行腹腔注射生理盐水（对照组）、HA微粉浸提液、乙醇分散Nano-HAⅠ浸提液和Nano-HAⅠ混悬液、铈盐分散Nano-HAⅡ浸提液和Nano-HAⅡ混悬液。尾静脉注射生理盐水（对照组）、乙醇分散Nano-HAⅠ浸提液和Nano-HAⅠ混悬液、铈盐分散Nano-HAⅡ浸提液和Nano-HAⅡ混悬液，注射剂量为50mL/kg。注射后，0h、24h、48h、72h、168h称量小鼠的体重，观察记录动物的一般状态，毒性表现和死亡动物数。材料毒性程度根据中毒症状分为无毒、轻度毒性、中度毒性、重度毒性和死亡。一周处死小鼠，解剖观察脏器变化，肝脏、肾脏做组织切片，镜下观察，对于混悬液组，观察有无Nano-HA栓塞在脏器的血管内。注射后动物反应观察指标见表1-2。

表1-2　注射后动物反应观察指标

1.3.2　实验结果及分析

所有动物在注射后1周内的活动、进食正常，无惊厥、瘫痪、呼吸抑制、死亡等不良反应，无肉眼可见的毒性表现，1周后动物解剖脏器观察，无坏死、出血、变性等病理表现，且未发现纳米羟基磷灰石造成血管栓塞的现象。各组小鼠在24h、48h、72h和168h（1周）的体重变化见表1-3和表1-4。各试验组腹腔注射与尾静脉注射各时期小鼠体重变化与阴性对照组比较的统计分析见表1-5和表1-6。

表1-3　腹腔注射的急性全身毒性试验小鼠体重变化情况（X±SD）　　单位：g

表1-4　尾静脉注射的急性全身毒性试验小鼠体重变化情况（X±SD）　　单位：g

表1-5　腹腔注射同期急性全身毒性试验结果的统计分析

表1-6　尾静脉注射同期急性全身毒性试验结果的统计分析

结果显示所有腹腔注射的小鼠各实验组和空白对照组比较24h、48h、72h和168h的体重变化没有显著差异。尾静脉注射小鼠中Nano-HAⅠ浸提液组和Nano-HAⅡ浸提液组与空白对照组比较24h、48h、72h和168h的体重变化，没有显著差异；Nano-HAⅠ混悬液组、Nano-HAⅡ混悬液组与空白对照组比较24h、48h、72h的体重变化，有显著差异，168h显著差异。

图1-6是铈盐分散的Nano-HAⅡ混悬液注射腹腔后小鼠肝脏和肾脏HE组织学图像。10倍观察小鼠肝脏和肾脏组织学，观察未见变性、坏死等异常［图1-6（a）和图1-6（c）］；40倍观察肝细胞多边形，细胞界线清晰，核膜清楚，核仁可见［图1-6（b）］；40倍观察肾小球、肾小管、血管均未见异常［图1-6（d）］。组织学切片对所有实验组和对照组肝脏、肾脏进行观察均未见变性、坏死等病理现象，细胞核完整，核仁清晰可见，胞浆染色正常，无异染物质。

图1-6　铈盐分散的Nano-HAⅡ混悬液小鼠肝脏和肾脏HE组织学图像

（a）肝脏×10；（b）肝脏×40；（c）肾脏×10；（d）肾脏×40

在急性毒性研究中，文献^［23］中认为HA的半数致死量为13.43g/L。本试验采用Nano-HA浸提液进行尾静脉注射、腹腔注射外，考虑到Nano-HA植入后有被吸收入血的可能，附加了Nano-HA混悬液组，发现只有浓度为10mg/mL的Nano-HA混悬液在静脉注射后24h、48h、72h小鼠体重变化与生理盐水组对照有显著差异，注射后1周没有显著性差异，腹腔注射各组鼠的体重变化与生理盐水组都没有显著性差异。1周后各组小鼠的肝脏、肾脏在大体观察时和组织学镜下观察均未见异常，说明不同分散处理的Nano-HA不含有害成分，10mg/mL浓度的Nano-HA混悬液虽在短期内可影响小鼠体重变化，但也是安全剂量，与文献^［24］的研究结果HA-sol的安全剂量9.85g/L相似。