孟德尔随机化方法在心血管疾病研究中的应用

近30年来，孟德尔随机化方法（Mendelian randomisation，MR）在医学领域的应用逐渐获得认可，尤其在心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）的病因预测和药物靶点开发中发挥了重要作用。本章结合MR方法的基本原理和经严格筛选的MR研究实例，重点探讨MR在CVD病因学和药物治疗靶点预测中的应用价值，并对MR在CVD应用领域存在的局限及进展进行简要阐述。

过去50年的流行病学研究证实了多种与疾病关联的生物标记物（如循环分子、生理特征或其他疾病）。尽管传统观察流行病学研究在吸烟作为肺癌致病因素中取得了巨大成功，但是被此类研究证实的具有强烈关联效应的大部分生物标记物最终未被发现有明确致病作用。事实上，生物标记物在疾病中分别扮演三类角色：旁观者、反向因果关系（疾病本身影响生物标志物水平）和因果关系（直接致病作用）。因此，从中筛选出致病因子对药物开发非常重要。然而，常规观察设计因不能祛除混杂因素（confounding）、反向因果关系（reverse causation）和偏差（biases）等干扰而易出现假阳性，据此设计的随机临床实验（randomized controlled trials，RCT）往往以失败告终。因此，那些因果作用不确定的生物标记物、大成本的药物研发投入以及伦理学限制等因素严重阻碍了药物开发的进程。作为迫切需要的一种新方法，MR研究应运而生。早在1986年，Katan首先提出孟德尔随机化方法可用于生物医学领域^［1］。

孟德尔随机化方法的命名起源于“孟德尔第二遗传定律”。该研究方法以孟德尔独立分配定律为基础，已知不同基因型导致不同的中间表型（intermediate phenotype，IP）（即待研究的暴露因素），用基因-疾病的因果链来模拟暴露因素对疾病的作用，推导出暴露因素对疾病的真实效应值^［2，3］。近年来，大规模的基因研究，尤其全基因组关联研究（genome-wide association studies，GWAS）为MR方法奠定了重要的遗传学基础。

MR研究设计必须满足以下基本原理^［4］（图1）：①既往研究证实的遗传变异只通过影响或模仿此暴露因素或IP的生物效应而与暴露或IP相关；②除了通过待研究暴露因素或IP外，这种遗传变异本身与待测结果无关；③这种遗传变异与其他已知和/或未知的混杂因素无关。由于配子形成时等位基因的随机分配，该效应估计值相比于传统流行病研究不易受到混杂因素的影响，因此采用MR研究可以科学、合理地进行病因推断，并控制混杂因素和反向因果关联对结果的影响^［5］。尤其重要的是，一个设计严谨和分析合理的MR所预测出的有确定因果作用的致病因子，对未来新药开发和RCT开展的必要性起着重要的决策作用。不同于RCT，MR将是否携带有特定作用的等位基因进行随机分配；而且，具有低成本的特点，即一旦某个种群开展过全基因组层面研究，某种程度上人们几乎可以凭借这些数据资料探索任何生物标记物。值得一提的是，MR并不能完全代替RCT，即使经MR预测有确定因果作用的致病因子，也需要在RCT中进行最终验证。

MR必须满足下列三个基本假设：①基因变异与一个暴露因素或中间表型（IP）密切关联，影响暴露因素或中间表型的活性或模仿后者的生物学效应；②根据已有知识该基因变异除模拟暴露或IP外与结果无直接关系；③基因变异不受已知或未知混杂因素影响。根据假设，如果LDLR基因变异升高LDL-C水平，升高的LDL-C与CAD存在可信赖因果关联，LDLR未通过LDL-C以外的其他危险因素与CAD关联，那么LDLR可以模拟LDL-C和疾病终点CAD发生因果关联。

MR方法学本身存在一定局限性^［6］，体现在以下几个方面：①部分研究样本量小，效应估计值小，致统计效能低；②连锁不平衡、基因-环境交互作用、人群分层等混杂因素影响；③基因多效性（pleiotropy）：指由于基因功能复杂、未知代谢通路造成的混杂；④基因网络中的发育代偿机制（canalization and developmental compensation）：指基因变异的同时，环境因素或发育过程中机体自身存在复杂的相互调节作用在一定程度上会削弱或补偿由基因变异所导致的表型改变，因此基因变异，但表型可能没有显著变化，从而使MR设计无法模拟而产生偏倚；⑤部分基因型与疾病的联系本身并不可靠；⑥人群发生率低的基因变异不适用此研究。因此，我们在MR设计和结果诠释时，需注意上述局限性的存在。

作为发达国家的主要死因，CVD病因学基础迄今尚不完全清楚。近30年来，MR方法学在CVD病因学预测方面已开展大量工作 ^［7］。由于MR本身方法学的局限，不同研究团队即使针对同一遗传变异-暴露或中间表型（IP）-待测结果所进行的不同人群或相同人群MR研究，结果也存在巨大分歧。因此，在评估MR预测生物标记物在CVD中的病因作用时，必须严格遵循下列筛选标准以纳入可靠的MR研究实例：①优选经F检测的工具变量（instrumental variable，IV）；②研究必须满足PowerAnalysis预测的样本量；③尽可能避免基因多效性；④尽可能避免其他混杂因素。结合这些MR研究实例，我们对MR预测多种生物标记物在CVD（如冠心病、高血压、心力衰竭、心律失常）中的病因作用进行阐述。

动脉粥样硬化性心脏病（atherosclerotic cardiovascular disease，ASCVD）包括无症状的亚临床动脉粥样硬化、稳定和不稳定型心绞痛、非ST和ST段抬高心肌梗死、心脏猝死和脑卒中。其中，脑卒中不在本文的讨论范畴，我们着重讨论亚临床AS和冠心病（coronary artery disease，CAD）相关的MR研究。冠心病是多种危险因素错综复杂、共同作用的复杂疾病。传统冠心病的危险因素，如年龄、吸烟、高血压、糖尿病、高胆固醇血症等并不能完全解释所有病因。目前，见诸报道的冠心病危险因素已多达200多种。近年来，流行病学和GWAS研究还证实许多新的危险因素，如脑源性神经生长因子、胎球蛋白-A、白细胞端粒酶长度、尿酸、胱抑素C和身高等，然而它们与ASCVD之间的因果关系尚不确定，有待阐明。

目前，观察研究和RCT研究证实升高的低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）与冠心病事件增加之间存在确定的病因关系；相反，高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和甘油三酯（TG）与ASCVD的因果关系尚不确定。尽管观察研究揭示TG和HDL-C与冠心病的关系，然而目前为止任何增加HDL-C或降低TG的RCT均未显示预期效益，可能归因于观察研究受到反向因果关系或混杂因素的影响。此外，阴性临床试验结果也可能源于药物靶标或药物分子选择匮乏。迄今为止，升高HDL-C或降低TG水平在预防冠心病事件中的作用尚不清楚。运用MR方法对血脂及其脂蛋白在冠心病中的病因作用进行预测非常重要。

在MR广泛运用于生物学研究之前，连接高胆固醇血症与冠心病风险之间的遗传证据就已存在。这些常见和罕见的遗传变异在多个MR研究一致表明，升高的LDL-C与增加的CHD风险存在有害因果关系^［8-11］。由于LDL-C相关的多个基因突变位点存在相应药物靶点（如HMGCR 基因区域对应他汀类药物，PCSK9 基因区域对应PCSK9抑制剂），因此它们被认为是MR研究的一个理想变量。在NPC1L1抑制剂依泽麦布（Ezetimibe）大型临床试验公布之前，以NPC1L1基因突变体为变量的MR研究就提前发表并正确预测了临床实验结果。一个析因设计的MR研究通过NPC1L1变异、 HMGCR变异和双基因变异导致的LDL-C浓度变化，以及变异作用强度的比较，证明了LDL-C是与ASCVD有因果关系的致病风险因子^［11］，探讨了他汀类药物和依泽麦布联合治疗可能带来的获益。有趣的是，基因预测的LDL-C致冠心病风险的因果效应远较他汀类药物获益高（达3.5倍），后者是基于30岁始服用他汀类药物持续5年的一级预防结果。一个可能的解释是基因预测LDL-C浓度变化是终生的，因此MR预测的是长期效应。基于MR和RCT结果，2016年ACC推荐了非他汀类药物降低LDL-C应用于ASCVD的管理^［12］。与此类似，MR 研究证实脂蛋白（a）［Lp（a）］区域多态性与CAD也存在有害的因果关系^{［13，14］}，而且MR预测风险较观察性研究高2.5倍，可能归因于这些基因变异与脂质的其他生物学特性（如粒子的大小或活动）有关，而不仅限于本身血脂水平。

不同于LDL-C和Lp（a），由于缺乏特异影响TG的基因变异（变异往往同时影响LDL-C和/或HDL-C水平）^{［15，16］}，TG与ASCVD二者因果关系难以明确。其中，多变量MR研究表明增加的甘油三酯与CHD存在有害因果关系^{［17，18］}。虽然多变量MR方法同时预测多个危险因素，但前提必须满足MR基本假设，即每个基因突变体关联的一个或多个风险因素必须与其他影响结果的风险因素无关，并且不通过其他通路实现因果作用。最近，MR研究证实残余胆固醇（remnant-C）也是ASCVD致病风险因素^［19-21］。remnant-C是指TG丰富的脂蛋白，被定义为在非禁食状态下，与乳糜微粒一起携带高含量胆固醇的极低密度脂蛋白（VLDL）和中密度脂蛋白（IDL）颗粒^［22］。Nordestgaard BG基于流行病学、遗传学和生物学的研究结果，新近提出“类似于LDL-C，高水平的富含TG的脂蛋白是炎症、ASCVD和全因死亡率的致病风险因素”^［23］。尽管目前大部分MR研究倾向TG与ASCVD存在有害因果关系，但仍有待验证。

同样，HDL-C相关的大多数基因变异对血清LDL-C或TG水平也有额外影响^［24］。这种基因多效性阻碍了HDL-C与ASCVD的因果关系确定。研究发现，一些与HDL-C似乎有特定关系的基因变异事实上与ASCVD风险无关。GWAS来源的HDL-C基因变异构建的等位基因积分法，在满足MR基本假设下，证明了HDL-C在ASCVD中的保护性因果效应^［25］。而Holmes研究发现，含有LDL-C和TG的等位基因积分法解释3.8%的HDL-C变异，结果显示HDL-C和ASCVD存在负关联风险；而去除LDL-C或TG的等位基因积分法仅解释0.3%的HDL-C变异，却揭示不存在任何因果关系。两者区别可能在于，后者缺乏更多揭示因果关系效力的变量^［26］。因此，多变量MR研究方法如果采用合理效力的变量，仍不失为一种有用的预测因果关系的工具。而Burgess开展的多变量分析（采用极其有限的基因变异）和Do开展的MR研究（未涵盖GWAS重要变量），没有揭示二者的真正因果关系^{［27，28］}。而考虑基因变异相对权重的多变量MR研究最近证实了HDL-C的保护作用；该效应较LDL-C小4.5倍，可能源于这185个基因突变位点具有多效性而引发残余偏倚^［29］。尽管标准MR涵盖全基因组的重要突变体揭示了HDL-C致CHD风险作用，而原始分析方法的采用，尤其大量遗传变异的使用可能导致虚假结果。近年来，两种新MR研究方法（MR-Egger和加权中值分析）在因果关系评估中提供了可靠证据，结果表明HDL-C与ASCVD存在零效应^［30］。因此，对这种遗传信息相对复杂的表型进行MR研究，有赖于更完善的分析方法。

T₂DM被认为是冠心病的一个重要的危险因素。ACCORD实验显示，强化降糖带来心血管获益^［31］。然而，一些RCT并未取得相一致的结果。既往3个MR研究提供证据支持增加糖化血红蛋白、禁食葡萄糖（fasting glucose，FG）水平、T₂DM与ASCVD风险之间存在因果关系^［32-34］。已知T₂DM和FG不依赖血糖本身，与其他促CAD机制（如体重、血清LDL-C水平、血压的增加和内皮功能损伤等）密切相关。因此，常规MR分析方法并不能完全排除遗传变异通过这些危险因素与CAD发生因果关联而高估通过糖尿病的致CAD作用。2017年Merino J等构建FG遗传风险分数（GRS），充分排除对血压、血脂和肥胖的影响后，证实高血糖相关的遗传变异可以分别通过糖尿病本身和其他促冠心病机制来增加CAD风险，揭示控制血糖本身确实可带来心血管获益^［35］。

流行病学研究和RCT提供有力证据，支持高血压是ASCVD的一个致病因素。目前为止，仅一项MR研究用于评估二者因果关系。研究结果发现，决定收缩期血压的GRS在最高五分位数较最低五分位数CAD风险增加70%^［36］。与血压本身比较，这些遗传变异倾向于直接致内皮功能损伤以增加CAD患病风险。需要进一步调查，来揭开二者因果关系。

流行病学和病例-对照研究（包括meta分析）表明，酒精摄入量与CVD存在U型曲线关系，即相对于不饮酒者，低到中度酒精摄入减少ASCVD风险。一项荟萃分析发现，乙醇脱氢酶1B（acetaldehyde dehydrogenase 1B，ADH1B）rs1229984 A等位基因携带者每周饮酒量少，相应CAD风险也低^［37］；而ADH1Brs1229984 A和乙醇脱氢酶1C（ADH1C）rs698为变量的横断面研究表明，长期饮酒增加血压和体重指数（BMI），但改善TG水平^［38］。尽管这些MR研究对“适度”饮酒的心血管获益作用提出质疑^［39］，但结果可能受混杂因素、选择偏差和一些生物学机制影响。因此，亟待设计严谨的MR分析方法来揭示二者真正的因果关系。

流行病学研究发现，大量摄入水果和蔬菜，降低CAD风险和全因死亡率，推测与其所含的抗氧化剂维生素C有关^［40］。然而，补充维生素的临床研究并未获得一致结果。一项SLC23A1为变量的MR研究揭示：丹麦人群摄入较多的水果和蔬菜能转化为较低的CAD风险和全因死亡率，类似于基因增加血清维生素C含量产生的效应^［41］。此外，观察研究表明大量摄入牛奶增加冠心病风险，可能与牛奶富含高胆固醇有关。然而，在丹麦人群进行的5.4年随访的MR研究发现，牛奶摄入量和CAD或MI之间风险为零^［42］。由于北欧人群明显不同于整个欧洲的饮食习惯，这一结果有待推广。虽然流行病学显示维生素D缺乏与T₂DM、ASCVD和其他ASCVD风险因素有关^［43］，而最近两项MR研究均否认遗传变异减少的p-25（OH）D水平与CAD 或 MI风险存在因果关联^{［44，45］}。

CAD患者脂肪、激素、尿酸等代谢异常的患病率明显增加，代谢异常本身也参与了冠心病的发生、发展。其中，超重和肥胖被认为是CAD的危险因素，然而肥胖是否独立于其他CAD危险因素（如糖尿病）成为致病因素尚存争议。肥胖和肥胖相关（FTO）的基因多态性与BMI有关。然而，FTO基因可能具有超越BMI本身的直接表型效应^［46］。两个BMI的GRS研究证实，即使矫正传统风险因素后，肥胖与CAD和早发CAD风险仍存有确定的因果关联^{［47，48］}。

目前，脂联素对ASCVD的直接作用尚不清楚。4个ADIPOQ突变体组成的联合变量和GRS的MR分析否认了基因减少的循环脂联素水平能增加胰岛素抵抗和T₂DM风险^［49］。双样本MR分析也显示这些遗传变异同时作用于其他多个中间表型，进一步支持脂联素与CAD无直接因果关系^［50］。

目前，雄激素睾酮与冠心病和心血管事件关系的流行病学研究并不一致^［51］。MR研究显示，基于遗传变异的促卵泡激素与男性和女性高水平雄激素均存在关联，且与CAD风险呈正相关；而遗传变异相关的抗苗勒氏管激素和睾丸发育不全综合征仅与男性低水平雄激素关联，且与CAD风险呈负相关^［52］。这提示雄激素似乎是一种可控的致病因子，尤其在男性敏感度更高。因此，急需一个以心血管事件为主要终点的睾酮替代临床研究来验证这个结果。

血清尿酸水平主要由SLC2A9基因编码的尿酸转运蛋白GLUT9决定。迄今的3项MR研究^［53-55］表明，无论采用常规方法，抑或非多效性SNP构建的尿酸GRS积分法，一致否定血尿酸水平与CAD风险之间的因果关系。因此，降低血清尿酸水平似乎并不降低CAD风险。

多个数据支持动脉粥样硬化的“氧化应激”假说^［56］。流行病学研究表明，高水平胆红素和同型半胱氨酸（tHcy）、高活性对氧磷酶和芳基酯酶、低活性sPLA₂以及低水平脂蛋白相关的磷脂酶（Lp-PLA₂）和胱抑素C等均具有抗氧化作用，可降低CAD或MI患病风险。MR研究发现UGT1A1 rs6742078变异升高的胆红素在矫正其他因素后并未减少CAD或MI风险^{［57，58］}，故既往阳性结果可能部分归因于血清胆红素关联的肥胖和血脂等危险因素致早期血管结构和功能作用。sPLA₂活性与ASVCVD及心血管事件之间的因果关系也被否认^［59］，sPLA₂可能扮演一个旁观者或反向因果作用。sPLA₂-ⅡA选择性阻断剂临床试验（VISTA-16）因未能降低ASCVD事件而被中止^［60］；与此类似，Lp-PLA₂活性抑制剂RCT（如SOLID TIMI 52等研究）的阴性结果也被欧洲人群4个MR荟萃分析所预测^［61-65］。虽然胱抑素C是不依赖肾功能的一种新型CAD危险因子，两项MR研究分别证实基因变异引起的胱抑素C升高与冠心病、脑卒中和心力衰竭风险无关^{［66，67］}。同样，对氧磷酶（paraoxonase-1，PON-1）基因变异影响血清对氧磷酶和芳基酯酶活性，与患CAD或MI病史者发生重大不良心脏事件风险无关^［68］。同型半胱氨酸代谢酶MTHFR C677T和GRS为变量的MR研究显示，高水平半胱氨酸虽然降低心血管死亡率，但不影响全因死亡率，而且在白人中未发现与CAD存在任何因果关联^{［69，70］}。因此，MR研究证实这些氧化应激相关的标志物与ASCVD均不存有任何因果关联。

炎症标记物是目前ASCVD药物靶点开发的一个热点。流行病学显示，循环炎性生物标志物［如C反应蛋白（C-reactive protein，CRP）、纤维蛋白原和白细胞介素-6（interleukin 6，IL-6）等］增加ASCVD风险^{［71，72］}。目前，MR联合GWAS在预测它们之间的因果作用中起着重要作用。其中4个MR研究提供强有力的证据，排除血清CRP水平与CAD之间的因果关系^［73-76］。JUPITER试验虽证实了他汀类药物的心血管获益，但更多反映了降脂效应而非CRP作用本身^［77］。因此，把降低CRP血清水平作为CAD治疗靶点不太可能获益。纤维蛋白原与一些已确定的ASCVD危险因素（如吸烟、肥胖和血脂）也存在关联。在调整上述危险因素后，一项MR研究也驳斥了基因增加的纤维蛋白原水平是MI的独立致病因素^［78］。目前缺乏关联IL-6的基因突变位点，IL-6通过结合白细胞介素-6受体（IL-6R）发挥促炎作用，采用IL-6R SNP（rs7529229和rs2228145）为变量进行MR研究，结果表明等位基因携带者IL-6水平下降，炎症反应显著降低，CAD事件也显著减少^{［79，80］}。IL-6R是迄今MR预测研究中，唯一与CAD有因果作用的炎症标志物。

上述传统危险因素（如性别、年龄、家族史、吸烟、高血压、糖尿病、胰岛素抵抗、肥胖、血脂异常等）在临床研究中备受重视并对其积极干预，但临床和基础研究发现仍有15%～20%CAD患者和25%早发CAD患者不具备上述危险因素，可能与其他一些新的标志物［如脑源性神经生长因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）、胎球蛋白 -A（fetuin-A）、白细胞端粒酶长度（leukocyte telomere length，LTL）、身高等］相关，因此需要结合新的生物标志物来提高心血管不良事件的预测率。然而，这些新的标记物在ASCVD中的病因作用尚不清楚。BDNF与血管生成和内皮完整性有关^［81］，目前针对BDNF与CVD关系研究相互冲突。我们研究小组证实，增加的循环BDNF水平可降低CAD风险和死亡率^［82］；而在弗雷明汉参与者组成的队列中，BDNFrs6265增加的BDNF水平不依赖于已知的其他危险因素（如慢性炎症、BMI、体力活动和抑郁等因素）降低心血管事件和死亡风险^［83］。升高的血清胎球蛋白-A也与其他危险因素（如增加TG和LDL-C水平、BMI、胰岛素抵抗和T₂DM）有关^［84］。MR研究发现，AHSG基因rs4917C等位基因增加的胎球蛋白-A水平和MI风险之间存在因果关联^［85］。反映炎症和氧化应激累积状态的LTL可作为CAD的一个生物标记物^［86］。一项结合荟萃分析和横断面研究的MR设计（囊括LTL基因相关的7个突变体组成的GRS）确立了二者的因果关系，即基因相关的LTL变短增加CAD风险^［87］。这些新的生物标志物，fetuin-A、LTL、BDNF均与冠心病有因果关联，然而限于单一的MR研究结果。其中，白细胞端粒酶长度因被认为同时影响其他已知的CAD风险因素（如氧化应激和炎症等）而成为争论焦点，但需要大规模临床研究进一步证实。

作为一个不可改变的危险因子，观察研究发现成年身高与CAD呈负相关^［88］。身高具有多基因复杂特质，尽管目前已知的基因位点超180个，但仅能解释10%的身高变异^［89］。一项荟萃MR分析显示，身高与CAD之间存在保护因果关联，而且在男性中尤为显著^［90］；另一项前瞻MR研究发现，成年身高每增加6.5厘米，CAD风险降低10%，可能机制在于改善血压、BMI和non-HDL-C等其他已知危险因素^［91］。

总之，MR研究为各种候选生物标记物和ASCVD的因果关系预测提供了重要的证据（图2）。部分候选标志物，如 LDL-C、Lp（a）、血糖、血压、肥胖、IL-6、BDNF、胎球蛋白-A、白细胞端粒酶长度、身高和维生素C摄入，已被证实与ASCVD有因果关联；而HDL-C、CRP、纤维蛋白原、胆红素、PON-1、sPLA₂-V、LP-PLA₂、尿酸、胱抑素C、维生素D、脂联素和牛奶摄入等候选标志物与ASCVD无任何因果关系。这些证据表明，一些长期存在的候选生物标记物（如HDL-C、CRP等）与ASCVD没有因果关系；同时，重拾了人们对既往因果作用不确定的生物标记物［如LP（a）、IL-6R等］作为药物靶点的信心。尽管如此，这些与冠心病有因果关联的生物标记物（尤其是可变致病因子），尚需在大规模临床干预或药物试验中获得证实。

原发性高血压（essential hypertension，EH）是冠心病和脑卒中最重要的危险因素。饮酒、吸烟、饮食、炎症、氧化应激、体重指数、尿酸和性激素水平等为常见的可变高血压危险因素。MR方法在高血压的病因学研究中同样发挥重要作用。同样经严格筛选后，仅涉及饮食行为、炎症、肥胖、尿酸相关的MR研究被纳入本文讨论范畴。

MR研究证实，ALDH2基因决定的较多饮酒量增加血压和高血压风险^{［92，93］}，而吸烟^［94］、维生素D水平^{［95，96］}、牛奶和咖啡摄入^［97］等饮食行为与高血压不存在因果关联。其中，决定当前吸烟量的rs1051730和rs16969968变量研究支持吸烟增加心率，但不影响SBP和DBP^［94］。与荟萃MR分析不同^［95］，24个相关基因组成的MR研究驳斥了观察研究揭示的25OHD与高血压的关联作用^［96］。基因决定的咖啡摄入量增多，也与肥胖、代谢综合征、T₂DM、腰围、身高、SBP、DBP 以及血脂水平无关^［97］。

IL-1受体抑制剂编码基因IL-1RN上游两个突变位点构建的GRS积分法显示，基因增加的IL-1受体抑制剂蛋白水平与血压无因果关联^［98］。

肥胖常与其他心血管危险因素并存，因此分析肥胖对血压的净作用非常重要。目前，2个荟萃分析和1个病例-对照MR研究分别采用32个肥胖相关SNP、14个BMI相关SNP构建的GRS、FTO 9939609和MC4R rs17782313为变量，结果发现变异指数增加的BMI与血压存在因果关联^{［99，100］}。

观察研究发现，血清高尿酸和高血压之间存在关联，而MR研究表明SLC2A9rs7442295基因决定的尿酸水平和血压之间没有因果联系^［53］，在Rotterdam研究却发现，该变异仅决定尿酸浓度变异的2.3%^［101］。而一项横断面尿酸GRS积分显示，尿酸增加与SBP和DBP减少有关，尤其在使用利尿剂的rs12498742 AA型患者中平均SBP减少；但未服用利尿剂的患者中未看到上述关联。

心力衰竭是老年人死亡率增加的主要原因，相关风险因素多种多样，其中CAD、MI、高血压和糖尿病是最常见因素^［102］。MR研究发现，KIV-2重复多态性变异增加的Lp（a）水平与心力衰竭风险有因果关联，然而目前无法排除Lp（a）是否依赖于MI发挥致心力衰竭作用^［103］。

心房颤动是增加临床发病率和死亡率最常见的心律失常。病例对照研究表明，炎症因子（如CRP、HSP27、IL-6、IL-8和TNF）血清水平升高、中性粒细胞和淋巴细胞比率升高等均与心房颤动有关^［104］。究竟炎症是心房颤动的发病机制，还是左房重构的结果（反向因果关系），目前尚不清楚。一项涵盖随访和横断面队列的MR研究表明，基因升高的CRP水平并未增加心房颤动的风险^［105］。

发达国家中主动脉瓣狭窄（aortic valve stenosis，AVS）的患病率高，目前尚无任何手段延缓疾病发展，因此寻求AVS病因非常重要。3个MR研究（其中2个为前瞻性研究）支持基因升高的Lp（a）水平增加成年后主动脉瓣钙化的发生率，并与AVS存在病因关联^{［106-108］}。前瞻队列研究发现，遗传变异导致的LDL-C水平升高也与主动脉瓣钙化和AVS有因果关系^［109］。因此，亟待RCT进一步验证降低Lp（a）和LDL-C在AVS中的作用。

静脉血栓栓塞（venous thromboembolism，VTE）多见于老年人，包括深静脉血栓（DVT）和肺栓塞（PTE）。对VTE的病因识别具有重要的临床意义^［110］。观察研究发现，VTE患者BMI高于对照组。最近，Klovaite等证实肥胖和深静脉血栓（包括合并肺栓塞的深静脉血栓）存在因果关系，二者危险比（OR）分别为1.13（0.92～1.39）和1.86（1.14～3.02）^［111］。因此，在肥胖人群中加强DVT的预防和早期检测非常重要。回顾和前瞻性研究表明，高同型半胱氨酸血症也是静脉血栓形成的危险因素^［112］，目前的两个MR研究结果并不完全一致。其中，Ray等汇总31个MTHFR和静脉血栓形成的关联研究，发现TT基因型与CC和CT基因型比较，发生VTE危险比为1.2（1.1～1.4）^［113］；而一项前瞻性研究并未发现MTHFR 677TT不同基因型与VTE存在病因关系，但在普通男性人群中血清高同型半胱氨酸水平可预测首发血栓形成^［114］。

尽管药物开发费钱费力，近年来仍有82%进入临床二期和50%进入三期的药物分子最终未获批准用于临床。分析这些药物开发失败的主要原因，发现并非由于安全问题，而在于疗效缺乏，提示当前药物靶点选择和验证方法可能并不完善。目前，通过体外试验和动物模型验证的靶点势必不能很好地转化为临床。观察流行病学虽提供人体证据，但往往易受混淆和/或反向因果关系的影响。

MR研究现分为两种类型：一种是预测生物标记物与疾病的因果关系，是最常见类型，鉴于大部分生物标志物受多路径影响（如LDL-C GRS积分法涉及LDLR、PCSK9、NPC1L1等通路），其药物研发价值较低；而另一种基于特定药物靶点的MR研究，如分别采用有相应靶点（依折麦布和他汀类药物）的NPC1L1和HMGCR基因变异为变量预测生物标志物水平和疾病风险关系，这种MR方法在药物研发中最理想。因此，在临床实验开展前可优先采用MR方法对假定为靶标的生物标记物进行预测和验证，帮助研究者确定其是否存在因果作用。然而，目前用于指导药物开发的前瞻性MR研究罕见。我们以图1中确定与ASCVD有或无因果关联的生物标记物为基础，从Citeline Pharmaprojects数据库中筛选出以这些生物标记物为药物靶点的RCT（包括正在进行的RCT），将RCT研究结果与MR预测结果进行对比分析（表1），以验证MR预测临床试验结果的能力。

作为制药业最成功的案例之一，他汀类药物因降低LDL-C水平和预防冠状动脉事件而获得巨大经济效益。早在20世纪50年代，观察流行病学就建立了高LDL-C和ASCVD之间的联系。胆固醇合成限速酶——HMG-CoA还原酶的发现提供了一个令人信服的药物靶标，随后大规模RCT证实HMG-CoA还原酶（HMGCR）抑制剂或他汀类药物降低LDL-C达25%，CAD风险减少达30%^［115］，如观察阿托伐他汀疗效的WOSCOPS和AFCAPS/TexCAPS研究^{［116，117］}。因此，MR研究确立的LDL-C病因作用进一步支持降低LDL-C预防冠状动脉事件。

影响LDL-C水平的另外一种蛋白质——PCSK9，通过结合LDLR而降解和减少细胞摄取循环的LDL-C。PCSK9功能突变降低的0.5～1mmol/L血清LDL-C变化能转换为50%和88%的CAD发病率降低，由此带来的心血管获益远大于本身LDL-C降低^［118］。因此，PCSK9作为药物靶标近年来被强化。其中，2015年ACC公布的OSLER-1和OSLER-2数据显示在标准治疗基础上，PCSK9抑制剂Evolocumab显著降低患者LDL-C和心血管事件的风险^［119］。2017年ACC最新发布的FOURIER实验结果进一步支持上述结论^［120］。2×2 MR析因设计几乎同步预测到：PCSK9或HMGCR基因变异所致的LDL-C每10mg/L的减少，使得CAD 事件同等降低（OR=0.81）^［9］，这是MR验证药物靶标的又一成功案例。

Niemann-Pick C1-like 1（NPC1L1）蛋白阻断剂Ezetimibe阻止肠道对胆固醇吸收而降低循环LDL-C水平。因此，Ezetimibe /他汀类药物联合治疗被认为是进一步降LDL-C的干预措施。最初的ENHANCE实验表明：与单独他汀类药物治疗相比，依折麦布联合他汀类药物治疗后LDL-C水平虽额外降低16.5%，但并未转化为主要终点（CIMT）的获益^［121］。尽管阴性结果源于设计缺陷，但Ezetimibe因此受到质疑。而3个MR研究均证实，NPC1L1基因变异引起的LDL-C水平变化与ASCVD存在因果关联；其中NPC1L1基因多态性和HMGCR基因多态性或者两者并存的2×2 MR析因设计显示，三组CAD获益类似^［10］。IMPROVE-IT临床实验表明，与辛伐他汀（40mg/d）的治疗相比，Ezetimibe（10mg/d）联合辛伐他汀治疗LDL-C水平额外减少15.8mg/dl，一级终点和心血管复合终点发生率分别减少6.4%和10%^［122］。因此，McPherson R等提出“CRT临床硬终点和MR研究成为成功拯救依折麦布的法宝”^［123］。

最早观察流行病学即显示，HDL与ASCVD呈负相关。胆固醇酯转移蛋白（cholesteryl ester transfer protein，CETP）抑制剂是一种促进胆固醇酯和TG在LDL和HDL之间转移的糖蛋白，维持HDL颗粒胆固醇含量，因此被认为是一种药物靶标。然而，四种CETP抑制剂已进入三期临床试验阶段。其中Torcetrapibi临床试验发现，虽然HDL水平升高72%，但CVD发病率反而增加25%，这可能源于血压升高的脱靶效应 ^［124］；其余CETP抑制剂因缺乏效力，也陆续被提前终止^{［125，126］}。虽然，针对CETP-TaqⅠB基因变异开展的MR研究表明HDL的CAD保护作用^［127］，但虑及CETP基因多效性影响，此保护作用不仅归因于HDL-C。研究发现，随着GSR积分增加，CAD保护作用增强；然而当GRS仅限于特异作用于HDL-C的基因变异时，这种保护作用被抵消，这表明其他脂质水平的改善（LDL-C和/或TG）影响了先前MR预测。目前，部分学者将这个结果解读为否定HDL作为药物靶点的强有力证据，其他学者认为总HDL-C水平可能并非一个适宜的中间表型。无论如何，CETP抑制剂的惨败重创了整个研发产业。因此，MR预测HDL与CAD存在不确定因果作用的证据应该作为缩减投资的一种警告。

MR研究否认sPLA₂活性与ASCVD及心血管事件之间存在因果关系。作为一种泛sPLA₂抑制剂，Varespladi有效地降低血清PLA₂-ⅡA、sPLA₂-Ⅴ和sPLA₂-Ⅹ水平。VISTA-1三期临床试验因增加心肌梗死的发病率（HR=1.66）而被提前终止^［128］。这是第一个预测出临床试验阴性结果的MR研究。

同样，MR研究否定Lp-PLA₂与ASVCVD及心血管事件存在因果关系。包括SOLID TIMI 52在内的两项临床研究表明，Lp-PLA₂活性抑制剂Darapladib没有减少冠状动脉事件的风险^{［64，65］}。MR研究同样预测出临床实验的阴性结果。

MR研究支持糖尿病与冠心病的因果作用。与此一致的ACCORD研究表明，强化血糖可降低糖尿病患者缺血性心脏病风险，其中5 年缺血性事件相对风险降低13%，心肌梗死、冠状动脉血运重建和不稳定型心绞痛这些非预设终点发生率也显著降低^［31］。

MR研究在白人中未发现高水平半胱氨酸与CAD存在因果关联。在合并血管病或糖尿病患者进行5年随访（HOPE-2研究）中发现：叶酸、维生素B₆和维生素B₁₂补充虽然显著降低脑卒中风险，但并未降低心血管整体死亡率和心血管联合风险^［129］。

大部分RCT和MR研究一致表明，降低LDL-C水平能减少冠心病事件。酰基辅酶A-胆固醇酰基转移酶（acyl coenzyme A：cholesterol acyl transferase，ACAT）催化胞内胆固醇酯化，促进巨噬细胞胆固醇沉积，促进动脉粥样硬化的发生、发展，由此ACAT曾被认为是一种有价值的药物靶点。而三期临床试验表明，ACAT抑制剂Pactimibe削弱了AS逆转，且增加LDL-C水平，后者可能是加速AS疾病恶化的原因^［130］。因此，临床LDL-C疗效观察似乎与路径、靶点设计密切相关。

IL-6R是目前MR研究预测与ASCVD有因果关联的唯一炎症标志物。针对IL-6R的单抗Tocilizumab可同时阻断膜结合的和循环中的IL-6R，已获许用于类风湿性关节炎的治疗。RCT显示Tocilizumab降低了类风湿性关节炎患者的血清IL-6、CRP、纤维蛋白原水平，同时升高血清HDL和LDL水平^［131］。因此，美国FDA强制要求在Tocilizumab治疗类风湿关节炎时，需同步观察心血管效应。综上，IL-6R有望成为未来ASCVD治疗的一个靶点。

虽然，目前倾向TG在CAD中的因果作用，但未完全确定。烟酸和贝特类药物RCT显示，降低TG水平并没有使CAD结果改善^{［132，133］}。由于这些药物靶点分别作用于HCAR2和PPARα通路（尚无MR预测研究），可能与TG-CAD路径无关。目前，基于APOA5和APOC3多变量MR研究表明，增高的甘油三酯水平与CHD存在有害因果效应，因此为人类提供了两种可能的药物靶标——APOA5和APOC3。虽然，正在进行的二期临床试验没有表明APOC3反义抑制剂与ASCVD之间有任何联系，但抑制APOC3合成和降低TG的作用非常明确^［134］，期待后续结果解决当前与TG因果作用不确定的问题，并提供有效药物靶点。

基于MR预测ASCVD病因学证据较充分，因此我们所做的一致性分析集中在ASCVD药物靶点上。上述分析结果表明，MR具有很好的临床试验结果预测能力。对个别不一致的结果，我们也分析了潜在原因。因此，鉴于目前药物开发的低效率，MR方法仍不失为提高药物开发成功率和最终获得临床推广的重要手段。

前面已介绍MR方法学固有的局限性，我们现针对CVD领域开展的MR研究，参考Mokry等分析结果^{［135-137］}，提出MR方法在CVD领域应用中还存有下列局限：①作为变量的基因变异同时影响多个表型性状或具有多种生物效应时，可能导致结果偏差，如TG或HDL的基因变异；②MR研究虽然确定生物标志物的因果关系，但很少直接识别生物标志物成为靶标的生物机制，如研究中并不清楚所选择的内源性雄激素SNP是否通过雄激素以外的其他因素影响ASCVD的风险；此外，一些作为变量的SNP（如部分LDLR的SNP）本身并不影响氨基酸序列，也未发现与其他影响中间表型的SNP存在连锁不平衡；③MR研究检测的生物标志物循环水平不能准确反映细胞浓度，可能还有旁分泌或自分泌信号的参与，也限制MR预测因果关系的能力；④某些MR研究可能仅仅提示生理状态的生物标志物存在因果关系，无法指定生物标志物在病理状态下的因果关系，除非有直接研究证据；⑤研究中采用的某些遗传变异只会在特定发育时期影响生物标志物的水平，如FTO基因在2.5岁以前与BMI呈负相关，直至2.5岁以后发育期才显著影响体重^［138］。因此，以上因素势必导致MR研究评估的疾病风险产生不确定结果。

为克服上述局限，一些新的MR方法（包括多变量、单倍体、两步法、双样本、双向、网络和析因MR）以及MR-Egger和加权中值等崭露头角。其中，多变量MR、析因MR、MR-Egger和加权中值等方法已应用于心血管疾病领域研究。一个简单的工具变量分析可能不会得出有效的因果关系，而多基因变异可能无法完全满足工具变量假设。最近，一种敏感度分析方法^［139］已逐渐应用于多变量MR研究中。该法预测的因果关系可以杜绝多变量研究带来的虚假结果，其可靠性毋庸置疑。

目前，以生物标志物为靶点的药物不总是能转化为成功的药物开发。尽管调查CVD生物标志物因果关系的MR研究在药物研发价值上远低于特定药物靶点开展的MR因果关系预测，然而前期的病因学研究显然有助于生物标志物的识别，这也是药物研发的第一步。如果MR研究最终证明生物标志物在疾病中不太可能有因果关系，可以帮助研发人员在药物研发中迅速减少投资或果断放弃。反之，当MR研究确定某生物标志物存在因果关系时，可帮助研发人员据此识别出正确路径，并调整生物标志物为下一个研发靶点。随着MR新技术的发展，MR在准确预测疾病病因和引导新分子转化为临床治疗靶点中，必将扮演更直接的角色。

（胡琴　张运）

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