第五节　失代偿肝硬化干细胞治疗

【概述】

失代偿期肝硬化是指各种慢性肝脏损害所导致的肝病晚期阶段，主要表现为门脉高压、肝功能减退和不能满足人体的生理需求。目前对失代偿期肝硬化的药物及介入治疗，均有一定局限性，即：不能逆转肝细胞数量日益减少导致的肝功能逐渐减退。人工肝支持治疗对于失代偿期肝硬化引起的慢性肝衰竭疗效也不尽如人意。同种异体肝移植虽然是有效手段，但由于供体、费用等原因，只有少数患者能得到治疗机会。

近年来，干细胞移植作为促进肝功能恢复的一项新技术为失代偿期肝硬化患者提供了一种新的治疗选择。骨髓干细胞可转分化为肝细胞以增加功能肝细胞的数量，也可通过与肝细胞融合促进损伤肝细胞的修复和功能的恢复。更多的研究认为，骨髓干细胞通过分泌多种细胞因子改变了肝脏局部的免疫微环境，进而促进了肝细胞的损伤修复和功能恢复。此外，大量的研究表明，低免疫原性的脐血干细胞和脐带间充质干细胞可用于异体移植并促进受体肝脏损伤修复。将骨髓来源的干细胞、脐血干细胞或脐带间充质干细胞通过肝动脉或外周静脉输注给失代偿期肝硬化患者，可增加干细胞在肝脏的富集与定植，进而促进患者肝功能的恢复。

根据干细胞的不同性质和不同来源，目前临床上干细胞移植治疗失代偿期肝硬化的方式分为6种：自体骨髓干细胞移植、自体外周血干细胞移植、自体造血干细胞移植、自体骨髓间充质干细胞移植、异基因脐血干细胞移植和异基因脐带间充质干细胞移植。自体外周血干细胞移植、自体造血干细胞移植和异基因脐血干细胞移植可能更适宜于治疗由肝炎病毒引起的失代偿期肝硬化，而自体骨髓干细胞移植、自体骨髓间充质干细胞移植和异基因脐带间充质干细胞移植可能更适宜于治疗非病毒性失代偿期肝硬化。需要指出的是，不同来源干细胞针对不同病因肝硬化的适应范围还需要进一步的临床研究以提供更高级别的循证医学依据。

干细胞移植多经肝动脉或外周静脉途径实施。考虑到多数失代偿期肝硬化患者存在不同程度的门静脉高压和凝血机制障碍，门静脉穿刺存在较高的出血风险。因此，一般不推荐经门静脉途径进行干细胞移植。上述移植途径的优劣未明，但对于细胞数量较多的移植如异基因脐血干细胞和异基因脐带间充质干细胞等，多经外周静脉途径进行移植，而自体干细胞移植则多使用肝动脉途径。

需要指出的是，干细胞治疗作为一项新的治疗技术，其临床应用应遵循国家有关部门相关的法律法规进行。本文为基本技术性规范，而非政策性文件。

【干细胞移植的方法】

在层流无菌治疗室内，选患者双侧髂后上棘为采髓点，局麻下抽取患者的骨髓血；在干细胞实验室内，从骨髓血中分离纯化获得骨髓单个核细胞；再到放射介入治疗室，借助血管介入将干细胞注射入患者的肝动脉。骨髓血的采集量一般在150～200ml，分离得到的骨髓单个核细胞总数在10⁹以上。由于失代偿期肝硬化患者通常存在不同程度凝血障碍和因脾功能亢进而引起的外周血血小板计数降低，多点骨髓穿刺存在一定的潜在出血风险。可于术前通过改善肝功能、输注新鲜冰冻血浆等治疗措施改善患者的凝血功能。为提高骨髓干细胞的含量，也可在采集骨髓前使用 G-CSF短期动员骨髓。通常采用小剂量（2～4μg/kg体重）的G-CSF动员2～3天，之后按照上述方法进行骨髓抽取、干细胞分离和移植。小剂量短期动员可促进骨髓干细胞的增殖，但并不促进骨髓干细胞向外周血的大量释放。经此种方法获取的骨髓血含有更多的骨髓干细胞（数量可达10¹⁰～10¹²），有助于提高治疗效果。

先使用G-CSF按照5～10μg/kg体重的剂量对患者进行3～5天的骨髓动员，将骨髓中的干细胞动员到外周血液循环中，再通过专用的单个核细胞分离机从外周血中富集、分离富含造血干细胞的单个核细胞（数量通常大于10⁹），最后借助血管介入将干细胞注射入患者的肝动脉。骨髓动员过程中应每天监测外周血中的造血干细胞含量，当CD34⁺细胞数量达到10⁶/kg体重时即可停止动员、转而进行干细胞的分离。由于骨髓动员会使大量的有核细胞进入外周血液循环、增加血液黏稠度，在正常人有增加血管内血栓形成的可能，但失代偿期肝硬化患者通常伴有凝血障碍和因脾功能亢进而引起的血小板计数降低，血栓形成的可能性并不会显著增加。应当注意的是，骨髓动员会促进单个核细胞在脾脏的富集，这对于脾脏肿大的失代偿期肝硬化患者有发生脾破裂的潜在风险。但临床上尚未有骨髓动员致脾破裂的报道。

CD34是人造血干细胞的主要标志，也有少部分造血干细胞不表达CD34但表达另一标志分子CD133。自体造血干细胞移植即使用纯化的、自体CD34或CD133阳性的造血干细胞进行移植。先按前述方法采集骨髓血，然后在干细胞实验室内进行造血干细胞的分离与扩增。通常借助CD34或CD133抗体和免疫磁珠从骨髓血中分离造血干细胞，也可借助流式细胞仪分选CD34或CD133阳性的造血干细胞，之后在体外对造血干细胞进行适当的扩增，使其数量达到10⁷以上，再收集细胞并经肝动脉途径移植回患者自身。此方法可减少骨髓用量，但需要在体外扩增造血干细胞，具有一定的技术难度，需严格遵守相关质控标准和干细胞生物学行为状态的评估，并应在具备相应条件的干细胞实验室内进行。

按前述方法制备骨髓干细胞。在干细胞实验室内，对骨髓干细胞进行贴壁培养，借此可去除不能贴壁生长的造血干细胞。在培养过程中应添加间充质干细胞生长因子，并可通过流式细胞仪监测间充质干细胞表型CD34^-CD45^-CD105⁺。当细胞数量达到10⁷以上时，即可收集细胞并经肝动脉途径对患者进行移植治疗。有研究表明，骨髓间充质干细胞的数量及增殖分化潜能随年龄的增长而下降，HBV感染患者的骨髓间充质干细胞分化潜能和免疫调节功能显著降低。因此，不推荐对老年患者和肝炎病毒引起的失代偿期肝硬化患者进行自体骨髓间充质干细胞移植治疗。

选择健康足月产妇，并经产妇知情同意。排除乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋病、梅毒及其他传染性疾病，无病理妊娠。胎儿娩出断脐后，消毒采血部位，应用装有血液保存液Ⅱ的一次性采血袋以封闭式采血法采血，每袋采脐血50～100ml。在干细胞实验室内，用负收集法分离提取脐带血干细胞。每例提取的脐带血有核细胞总数应达10⁷以上，以生理盐水稀释，经肝动脉或外周静脉途径（通常采用肘正中静脉或前臂静脉）进行干细胞移植。经外周静脉途径应选择输血器，开始输入速度稍慢，同时注意观察患者情况，避免应用输液泵。

脐带取自健康足月胎儿，并取得父母授权同意。采用机械加酶学消化的方法将脐带分离成单个细胞。对脐带细胞进行贴壁培养，在培养过程中应添加间充质干细胞生长因子，并通过流式细胞仪监测间充质干细胞表型CD34^-CD45^-CD105⁺。虽然间充质干细胞在体外可被扩增至50～100代，但一般推荐使用4～6代以内的脐带间充质干细胞进行移植治疗。移植的细胞数量应在10⁷以上，可以经肝动脉或外周静脉途径（通常采用肘正中静脉或前臂静脉）进行移植，注意事项同上。

【临床应用】

每一项移植治疗技术应当有完整的标准操作规范，并经医院伦理委员会和新技术委员会批准。

负责骨髓、外周血、脐血、脐带采集以及干细胞分离的专业人员需要经过相关的业务培训。患者的选择和干细胞的移植需要相关专业副主任医师以上人员负责实施。

有洁净度达1万级的实验室，需要生物安全柜、离心机和超净工作台。拟开展外周血干细胞移植的单位要有血细胞分离机。进行干细胞表型检测的还需要流式细胞仪。

（1）各种病因导致的肝硬化，肝功代偿不完全；

（2）HBV或（和）HCV感染相关肝硬化经有效抗病毒治疗后，Child-Pugh评分仍处A级以上；

（3）近半年内，虽经积极治疗，病情仍有反复或加重，至少因肝硬化并发症如自发性腹膜炎、或肝性脑病住院1次以上；

（4）需间断补充血浆白蛋白及口服利尿剂治疗；

（5）无条件接受原位肝移植；

（6）自愿签署知情同意书。

（1）有以下既往史的患者：1个月内有上消化道出血病史；有酗酒、药物滥用史，并未能有效戒除者；过敏体质。

（2）有以下疾病、合并症或症状的患者：合并肝脏或其他脏器的恶性肿瘤；并发消化道出血；肝性脑病Ⅲ期及以上；肝肾综合征；感染未能有效控制；大量腹水。

（3）有以下指标者：白蛋白持续低于25g/L；严重的电解质紊乱；凝血酶原活动度<20%；血清HBV DNA或HCV RNA>1000拷贝/ml；Child-pugh评分C级或MELD评分>40。

（4）妊娠期或哺乳期妇女。

（5）有严重的心、脑、肾或血液系统疾病以及衰竭状态患者。

（6）有其他原因，经主管医生判断不适于干细胞治疗的患者。

（1）大量腹水、严重肝性脑病、感染未能有效控制者，确需干细胞移植者，可在腹水基本消退、肝性脑病纠正、感染有效控制后进行。

（2）上消化道内镜或其他检查提示严重食管胃底静脉曲张和门脉高压性胃肠病变，近期出血风险较高者，应视情况应用药物、内镜治疗或TIPS治疗，门脉高压有效控制、消化道出血风险降低后进行。

由于失代偿期肝硬化患者病情重，病程长，对干细胞移植治疗缺乏了解以及手术时亲人不在身边等原因，患者术前会焦躁不安，缺乏安全感。应详细地向患者及家属讲解干细胞移植方法的优点及其不足之处，使患者及家属对干细胞移植治疗有一个正确的认识。并注意说明干细胞移植的过程，必要时可通过既往的视频和宣传手册让患者了解治疗过程，或向患者介绍以往成功病例，以达到消除患者紧张心理，增强患者的治疗信心。

对于需要抽取骨髓以及需要经肝动脉移植的患者，对取髓和股动脉穿刺部位备皮。术前进行碘过敏试验。术前6h禁食水，通过静脉输液保证患者的基本营养和能量需求。

骨髓血、外周血、脐血和脐带的收取、转运应有专人负责，并做好标识和记录。制备过程必须在1万级洁净实验室内按照标准操作流程进行，严格无菌操作。根据干细胞种类和要求的不同，选择使用密度梯度离心法、免疫磁珠法、流式细胞仪分选法或全自动血细胞分离机进行干细胞的分离富集。需要体外培养和扩增的干细胞在培养过程中需要注意定期更换培养液、及时传代。脐血干细胞和间充质干细胞可按照标准程序冻存于液氮罐，待使用前按照标准程序解冻复苏。制备的干细胞可经生理盐水稀释到需要的容积，及时进行干细胞移植。稀释于生理盐水的干细胞只能在4℃冰箱短时间保存。可通过细胞计数和活力测定对干细胞进行质量检测，有条件的可使用流式细胞仪进行干细胞表型的鉴定。

一般经肝动脉或外周静脉途径进行干细胞移植。

在局麻下穿刺股动脉，放置动脉鞘管；用导丝和导管选择到肝固有动脉进行造影，观察肝内血管情况及有无占位性病变；将干细胞悬液经左右肝动脉缓慢注入；术毕拔管，穿刺点加压包扎后返回病房。

取肘前正中静脉或前臂静脉穿刺建立静脉通道，可酌情应用预防过敏药物；应用输血器，以生理盐水冲管，之后缓慢输入干细胞悬液，期间注意轻柔挤压或颠倒输液袋以保持细胞悬浮，最后以适量生理盐水冲管。

1.术后根据需要应用抗菌药物。

2.对于经肝动脉途径进行干细胞移植的患者，一般需要穿刺侧下肢制动6小时，卧床24小时。

3.术后可连续使用促肝细胞生长素1～2周。

目前临床应用尚未发现严重的不良事件。已经报道的安全性事件主要是术后低热和恶心，多为自限性。少见的事件有穿刺点出血和血肿、穿刺点疼痛、肝区不适，经对症处理后缓解。由于干细胞移植的临床应用时间较短，目前仍应密切注意干细胞移植后是否会发生免疫排斥和诱发肿瘤，也应注意肝肾等重要脏器功能的变化。一旦出现严重不良事件应按规定报告医院以及相关主管部门。

由于失代偿期肝硬化尤其是并发腹水和（或）上消化道出血的患者病死率高、生存期短，应注重以生存期作为主要指标评价干细胞移植治疗的效果。肝脏合成功能、临床表现等可作为次要评价指标。

（1）生存期：加强对患者的术后随访，以死亡作为随访的硬终点。

（2）血液生化学指标：以血清白蛋白水平为主，兼顾血清胆固醇、胆碱酯酶水平和凝血酶原活动度，此4项指标可在一定程度上反映肝脏的合成功能，其他生化学指标还包括转氨酶、胆红素、碱性磷酸酶、γ谷氨酰转肽酶和甲胎蛋白等。

（3）终末期肝病评分模型（the model of end-stage liver disease，MELD）和Child-pugh评分；有条件者可行吲哚青绿代谢试验，评估肝脏的储备功能。

（4）临床症状：多数临床报道显示，干细胞移植可有效减轻失代偿期肝硬化患者的乏力、纳差、腹胀等症状，并促进腹水的消退。

（5）肝纤维化指标：借助Fibroscan、Fibrotest等检测干细胞移植前后肝脏纤维化程度的变化。

（6）影像学指标：可通过B超、强化CT或磁共振检查，观察肝脾大小或容积以及门脾静脉内径的变化。也可借助上消化道内镜观察食管胃底静脉曲张和门脉高压性胃肠病的改善情况。

（7）肝脏穿刺活检：对于条件合适的患者，可通过比较术前术后的肝脏穿刺活检明确干细胞移植对肝脏病理学的影响。由于该检查有一定的创伤，建议谨慎使用。

应根据患者年龄、病情及治疗效果确定合理随访间隔及随访内容。一般不超过现有肝硬化有关指南推荐的随访时间间隔；每次随访均应注意生存期，随访项目按肝硬化相关指南要求，注意MELD评分和Child-Pugh评分及ICG15的变化；观察有无肿瘤发生；同时注意出血风险评估。如果患者具备接受肝脏穿刺活检的条件，建议在干细胞移植术后1～2年时进行。

（王晶波）

参考文献

1.干细胞移植规范化治疗失代偿期肝硬化的专家共识.中华医学会医学工程学分会干细胞工程专业学组.中华细胞与干细胞杂志（电子版），2014，4（4）：222-226.

2.中华医学会肝病学分会，中华医学会感染病学分会.慢性乙型肝炎防治指南（2015年更新版）.临床肝胆病杂志，2015，31（12）：1941-1958.