第三章 医院感染的微生物学诊断
一、微生物学实验室在医院感染诊断中的地位
微生物学实验室在完成医院感染病原学诊断、指导治疗及评价疗效、在参加涉及医院感染的监测与流行病学调查（重点是暴发调查）、各项防控措施效果的评价等，均负有其他部门不可替代的重要作用。可见，微生物学实验室不仅是检验科承担重要业务工作的组成部门，而且是关系到包括医院感染管理在内的医院医疗质量的业务和管理并重的部门。
2004年8月由卫生部（现国家卫生计生委）、国家中医药管理局及总后卫生部印发的《抗菌药物临床应用指导原则》中要求，尽早查明感染病原，根据病原种类及细菌药物敏感试验结果合理选用抗菌药物，就体现这一点。
国内外的实践表明，凡是医院感染管理工作做得好的，都能看到微生物学实验室工作的贡献与影响。凡是重视微生物学实验室建设与技术人员配备与培训的医疗机构，医院感染管理工作成绩都比较好。
必须正视的一点是，目前微生物学实验室的建设还不能满足临床工作的需要，甚至尚存在“盲点”，近十余年先后在临床上诊断了千余例巴尔通体感染，无一例经过病原学分析。目前，不少医疗机构甚至是三等甲级医院对厌氧菌、结核分枝杆菌、L型细菌等的培养及鉴定还远不能满足实际工作的需求。
当前的现实是，引起医院感染的病原微生物尽管涵盖了各类微生物，但重点仍然是病原菌，尤其是各式各样的耐药菌，至于其他病原微生物，如病毒等尚处于待开展或刚刚起步的阶段。当前赋予微生物学实验室的任务极为明确，在防治、控制与管理医院感染的责任十分重要。
二、微生物学实验室在医院感染诊断中的任务与职责
（一）把好标本质量关是第一任务
规范采取病原学检查标本，是完成病原学诊断的前提，它关系到提高检出率和避免假阴性及假阳性，将会影响对检验结果临床意义的评价。标本质量一定要从采集前准备开始抓，经过采集标本全过程，直到安全后送到实验室为止。这是确保微生物检验质量准确可信的关键与前提。
应制定正确釆集、运送（多数标本应在常温下2小时内送达实验室）、接收和处理标本的指南，把标本被污染的可能性降到最低，这对保证实验室检验质量的可信度是极其重要的。对标本从收集开始到完成检验的整个流程，实施严谨的监督是必不可少的。
与此同时，临床医生或标本送检者仔细逐项、准确填写化验申请单，提供给实验室工作人员充足的相关信息，对选定最适宜的检验方法是有益的。
采集标本大多数由临床第一线医护人员完成，也有由患者及其亲属或陪护完成，有的则需由微生物学实验室工作人员亲自参与，譬如组织标本的采取最好由实验室人员在手术台旁等待收取，置于放少量（过多则可能使标本漂浮！）灭菌生理盐水的小瓶内，立即返回实验室做微生物学检查。建立采集标本者在检验申请单上签名的方式，也许对保证标本质量是有帮助的。
无论采标本的人是谁，注意点都是一样的，即以无菌方法取样，放置于培养用的无菌容器内，防范采样后可能遭受的再污染（如容器未盖严密或盖子在运送过程中松动等）。
为避免受采集处正常菌群的污染，除大家熟知的皮肤消毒外，有时应充分清创后，切取小块组织做定量培养，或用针头吸取深部材料送检。常用于烧伤、压疮、静脉曲张处的溃疡、牙周病变及肛周脓肿等。
对少数需用拭子采集标本的情况，一般不用干拭子，有标本量少而又极易干燥的缺点，至少先用无菌盐水浸透，或浸入非营养型的运送培养基中后送。棉签及其木棒或竹签中可能含有脂肪酸、树脂和残留的消毒剂，均可影响培养结果。供培养用的粪便标本，除供分离肠道菌的标本外，不要浸在运送培养基中送检。另外，若需做结核分枝杆菌与真菌检查，不适合用拭子采集标本。实际经验表明，对渗出液的一般微生物检查，直接用空针抽吸后注入封闭的灭菌小瓶内，远比用拭子采样好。
要养成一种始终关注标本质量的风气，科室做到不合格的标本不送检，微生物学实验室应拒收或退回不合格的标本，并将出现不合格的原因反馈给有关科室与人员。微生物学实验室若用明知不合格标本做检查，必将出现不合格的检验结果，即假阴性和假阳性，这不是检验人员和医务人员的意愿。
无论何种标本，通常在发病初期采集，或者来院后尽早采集，应该是越早越好。如从死者采取标本，应该在死后3小时以内完成。
采样后及时送检也是不可忽视的，如尿液标本在室温下放置2小时以上，即使其培养的细菌数≥105CFU/ml，亦不应作为诊断依据。
为提升标本的检出病原菌阳性率，应尽量采取存在病理成分的标本，如粪便的脓、血或黏液部分；再如采集标本务必要取足够的量（尤其是血培养的血量），有文献称，从1ml到10ml，每多采1ml血，可提高3%的检出率。
对痰液标本来说，标本质量的筛选有它的特殊之处。自然咳出的痰液不可避免地要经过有菌的上呼吸道与口腔，被污染的可能性极大。筛选的方法是痰液涂片镜检，标准是鳞状上皮细胞<10个/低倍视野和白细胞>25个/低倍视野，或两者之比为≤1∶2.5。对免疫处于抑制状态的患者和粒细胞缺乏患者来说，见到柱状上皮细胞或锥状上皮细胞与白细胞同时存在即可，不需严格限定白细胞数量。
关于死后取标本做细菌培养不是一项常规的诊断步骤。原因是正常菌群在死后发生移位，扩散至体内死前并未累及的其他组织，很难说明其临床诊断价值。假如多处组织均培养出同一种细菌，或皆为纯培养，又与死前的临床表现相对应，具有一定的参考价值。
一言以蔽之，把好标本质量关是第一任务，是达到努力提升准确可信的检出率，又要避免假阴性或假阳性这一目的的条件。
（二）把好标本检验质量关是核心任务
为保证医疗质量和医疗安全，我国国家卫生和计划生育委员会相继发布了《2012年全国抗菌药物临床应用专项整治活动方案》、《预防与控制医院感染行动计划（2012—2015年）》和《抗菌药物临床应用管理办法》等，强调了临床微生物学检测质量对感染性疾病防控的重要性和必要性。首先是做到检验结果准确可信，并及时提供给临床人员与医院感染管理人员，要从制度和程序上保证实验室操作符合标准是工作基础。我们期望，我国能尽早制定规范的感染性疾病微生物实验室诊断应用指南，更好发挥微生物学检验结果在感染病临床诊断中的重要作用。
对临床人员而言，其直接结果必然是提升了感染性疾病的诊断水平，避免了不必要的或不合理的抗生素应用，有利于减少经验性应用抗生素；对医院感染管理人员而言，可完善管理程序与内容，强化了针对性，如对多重耐药菌感染者的及时而合理的隔离与管理等。
为力争检验结果具有“快”的效应，培养前直接镜检常能发挥重要作用。以涂片染色后镜检为例，如见到革兰阳性球菌，既可帮助医师们选药，还可为培养选择适当的培养基；如见到较多的真菌，也可将标本接种到分离真菌的培养基；如发现可疑的芽胞或荚膜，则应做芽胞或荚膜的染色后再镜检；如未见细菌和真菌，则应再用吉姆萨染色或其他适当染色后，注意脱落细胞中有无包涵体。当涂片上可见大量细菌而培养却为阴性时，或与标本中含有一定浓度的抗菌物质有关，也要留心有无厌氧菌存在的可能。除用光镜直接镜检这一基本方法外，还可用相差显微镜观察，后者虽不能区分革兰阳性和革兰阴性，但可检出某些细菌及真菌的特殊结构等。
其次是力争把假阴性或假阳性结果“消灭”在实验室，实质上关系到实验室的质控问题。例如自一位并未应用过抗生素的脓肿患者采集到的脓液涂片上观察到细菌，但未能分离到细菌，则应考虑是否可能存在厌氧菌感染，需改用适宜厌氧菌培养所需的条件再另取样培养。再如一份痰标本涂片染色后，见到多种形态的细菌，而需氧培养仅获得流感嗜血杆菌，这并不意味着患者一定是流感嗜血杆菌感染，很可能是需氧菌和厌氧菌的混合感染。严格地讲，把混合感染因检查出某一细菌误判为单一细菌感染，此类漏检现象也应归入假阴性的范畴，遇到阴性结果时，应积极寻找与分析原因，以避免假阴性引起的误导。
反之，如多次发生标本被污染的情况，一定要寻找原因；凡不合格的标本一律不进入检验程序，并请原送标本的病区或科室重新另送合格标本，以避免出现假阳性结果，最大限度地限制无关病菌的干扰。如有必要，检验医师最好主动去病区和临床医护人员一起采集标本。
不受实验室“欢迎”的标本采集和递送方式，主要是两种。一种是拭子采集的标本，用拭子采集的标本量少，不适合去检测含量不多的病原菌，不能直接做涂片革兰染色检查，也不宜用于厌氧菌培养。另一种是用注射器采集的标本，临床医护人员应尽量避免。此类标本在取样过程中存在发生职业暴露的风险，且无法预知待检病原微生物对人的危害，应急处理有难度。
当然，引起医院感染的病原微生物，除已知的需氧菌和厌氧菌外，尚有新近发现的细菌或真菌（如军团菌、伊氏肺孢子菌），学者们还注意到一些少见的或不易鉴定的细菌，也可能成为引起医院感染的病原菌。还有多种真菌及病毒等亦可引起医院感染。此外，上述这些病原微生物，亦应纳入实验室的检验范围。
关于病原微生物的抗原、抗体与核酸的免疫学、分子生物学检测等，在许多医院尚待开展。
这一病原微生物的多样性特点，使微生物实验室面临相当复杂的工作任务，对难以鉴定的菌种要送至上级实验室鉴定。
（三）关于细菌耐药性的检测
细菌耐药已成为全球所面临的公共卫生问题。当细菌感染与抗生素耐药相关时，其抗感染效果下降，不仅延长住院日与额外增加医疗费用，关键是导致其致死性可能变得更强。例如，2007年在欧洲的多重耐药菌感染约为40万例，结果有2.5万例患者死亡。我国的细菌耐药情况较为突出，临床分离的多重耐药菌比例较高，占30%~60%。为此，世界卫生组织将2011年世界卫生日的主题定为“抵抗抗菌素耐药性——今天不采取行动，明天就无药可用”。当前的形势是医院内感染，尤其是在ICU获得的感染，从这些感染所检出的致病菌中，耐药菌的比例明显高于社区感染及非ICU获得的感染。
实践表明，微生物学实验室坚守规范检验流程的原则，不断充实与（或）更新的检验技术和手段，并有相应的人力与设备，是保证检验质量，使结果准确可信的基础，也是构成整个医疗活动（包括医院感染防控）正常运转不可缺少的有机组成部分。
三、微生物学实验室在医院感染管理中的任务与职责
医院感染防控工作与微生物学实验室的支持和参加息息相关。首先是涉及医院感染的病原学诊断，不仅提升了诊断质量，并用于有循证依据的病原学治疗。如为耐药菌所致的医院感染，对选用敏感药是有积极价值的。其次是在医院感染监测系统中发挥重要作用，对开展流行病学调查起着不可替代的作用。假如院内有医院感染暴发的苗头，实验室往往是最早掌握信息的。第三是适时对本单位检出的病原微生物结果进行归纳和分析，并通报给医院感染管理科。
一言以蔽之，实验室不是单纯接收标本做微生物学检查的，而是参加医院感染“监、控和管”的重要部门。过去用“配合”两字来定位其任务与职责是肤浅的，已被大家放弃。
四、微生物实验室获得的信息对防控医院感染的重要意义
微生物实验室获得的信息，是实施医院感染管理的基础，必须从每一个体（主要是患者）和医疗机构（至少是一个病区或科室）的群体（主要是患者，有时还需要包括工作人员）两方面去分析与评价。
在一间医疗机构内，真实、准确的医院感染发生率必须由临床方面的资料与实验室方面的资料结合起来确定。卫生部（现国家卫生计生委）在2001年印发的《医院感染诊断标准（试行）》中，就要求“医院感染按临床诊断报告后，力求做出病原学诊断”。在实际工作中，大约80%左右的医院感染，应该获得相应的实验室涉及病原学资料的证实。
实验室资料只能表明某种微生物的存在，当与患者的临床资料对应后方能判定其意义，即检出的微生物与已发生的感染是否有关，如认为与已发生的感染无关，则只能认定为“定植”。
对每例发生医院感染的患者来说，当检出病原菌后，首先是完成了病原学诊断，并结合药敏试验结果指导抗感染治疗，有利于合理应用抗生素。对医院感染管理者来说，“感染”与“定植”均具有流行病学意义。例如通过流行病学调查分析感染的来源与传播路径，为终止其传播制定控制措施提供依据。再如各种病原菌感染的分布（时间与空间分布、在不同患者中的分布），阐明感染的特点、程度、范围及趋势，为揭示感染来源、传播方式与高危因素提供信息，为监测是否出现暴发先兆提供“警示”，也为感染是否获得有效控制提供考核的客观依据。
可见微生物实验室获得的资料，是对医疗质量与医疗安全有积极作用的重要资料。及时、客观、准确及顺畅传递相关信息，是微生物实验室工作人员和医院感染管理人员的义务与责任。
为完成上述任务，微生物实验室工作人员的报告方法可分几步走。当收到不合格标本后，应及时退回送出科室（最好是送回给主管医师或填写检验申请单的医生），或告知有关科室及人员，敦促其重新规范采集合格标本，及早启动病学检查程序。其次是分离出经初步鉴定的病原体后，应快速向主管医师（或值班医师）通报并报告医院感染管理人员，主要是以口头方式完成。第三是完成最后鉴定后，一边报告（主要是书面方式，也可借助电脑传递）有关科室及人员，一边进行药物敏感试验。最后，在完成药敏试验后提供包罗全面检验信息的正式的书面报告。
为完成上述任务，微生物实验室工作人员还应与医院感染管理人员适时、主动进行信息交流。理由是一些重要检验结果，例如检出致病菌（如结核分枝杆菌）、耐药菌（如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、产超广谱β内酰胺酶的肠杆菌科细菌）或较少见的细菌，或连续从某一病区或某一标本检出某一种细菌，与医院感染管理人员应适时进行信息交流，并由他们牵头进行流行病学调查，不必由实验室工作人员直接向相关单位发出预警警报。流行病学调查往往以实验室资料作为“切入口”，但完成调查尚需做一系列工作，包括对相关患者（发现不典型或轻症患者、带菌者）的采样，相关环境的标本采集等，还是需要实验室人员参加的。
五、和微生物实验室工作人员全方位合作，是高质量完成防控医院感染的保证
应该认识到，微生物实验室工作人员和医院感染管理人员，是完成同一任务的战友，彼此只是分工不同而已。当前，对病原菌耐药状况的持续监测，剖析其流行病学特点，并预防耐药菌的产生和蔓延扩散，评价其相关对策的效果，应该是医院感染管理的基础之一，也是始终不能松懈的中心工作。一旦离开了或放松了病原菌耐药状况的监测，或者存在来自某个方面的干扰，必将动摇医院感染“防、控、管”措施的实施。
此外，适时引入相关的新诊断技术与方法，提高诊断的准确性、快速性和阳性率，促进感染性疾病的诊治与“防、控、管”，也是微生物实验室工作人员与全体医护人员、医院管理人员的共同任务。