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第二节 新发传染病的实验室诊断流程路线图和标本采集
(郑江花)
一、新发传染病及其主要病原体
1997年世界卫生组织 (WHO)提出了新发传染病 (emerging disease)、再发传染病(re-emerging disease)的定义。新发传染病是指新出现的影响到公共卫生的传染病,再发传染病是指一度曾被遏制,但又再次使患者数增加而成为公共卫生问题的传染病。新发传染病的种类之多,引起世人瞩目,至今达40余种。且其病原微生物种类复杂,有非细胞型微生物、原核细胞型微生物和真核细胞型微生物。非细胞型微生物是最小的一类微生物,无典型细胞结构,无产生能量的酶系统,只能在活细胞内存活繁殖,核酸有DNA或RNA,例如各种病毒和朊粒。新发传染病病原体绝大多数是由病毒引起,例如寨卡病毒、艾滋病、埃博拉出血热、SARS、克雅病、禽流感、莱姆病、登革热、新型流感病毒和戊型肝炎等。另外一类新发传染病病原体是原核细胞型微生物,有环状裸DNA结构,细胞器很不完善,DNA和RNA同时存在,根据16S rDNA序列分析可分为目前认为不致病的古生菌和广义的细菌,包括窄义细菌、立克次体、衣原体、支原体、螺旋体及寄生虫等。例如大肠杆菌O157、结核分枝杆菌和非典型分枝杆菌、埃立克体病和军团菌等。最近新发传染病病原体感染报道很多是真菌,上升趋势明显,尤其是条件致病性真菌感染更为常见。例如组织胞浆菌、耶氏肺孢子菌和马尔尼菲蓝状菌等,均属于第三大类的真核细胞型微生物,细胞核分化程度高,细胞器完整,存在于人类、动物和植物体表,以及与外界相通的人类和动物的呼吸道、消化道等腔道中,种类繁多,分布广泛。
人类对新发传染病认识还远远不够,其防治方法掌握有限,又无天然免疫力,对人体健康造成严重危害,同时给社会经济带来极大损失。新发传染病的传播速度快,波及范围广,受染人数多,例如2015年5月以来在巴西等美洲中部和南部地区发生寨卡病毒感染暴发流行,疫情至今不断蔓延和扩展,至2015年12月报道约130万例寨卡病毒感染病例。世界卫生组织 (WHO)2016年2月1日宣布寨卡病毒正在美洲地区 “爆炸性传播”,并于9月15日报道有72个国家报道寨卡病毒通过人传人进行传播,新生儿小头畸形和其他神经系统病变构成 “国际关注的突发公共卫生事件”。我国在2016年2月9日已有寨卡病毒病的输入病例,此后,北京、广东、浙江等陆续发现输入性病例。新发传染病目前已成为全球重要的公共卫生问题,对整个人类构成严重威胁,其不分年龄、性别、生活方式、伦理背景和社会经济状况,连世界最发达的美国也未能幸免。例如埃博拉出血热在非洲以其极强的传染性、极高的病死率而被称为 “死亡天使”;莱姆病已遍及五大洲70多个国家,在美国其危害仅次于艾滋病;在英国出现的疯牛病已导致约20万头牛受到感染,特别是与疯牛病相关的高病死率的人类新型克雅病的出现,触发了全球性危机,引起了国际社会的震撼;其他如军团菌病、禽流感等都曾在一些国家和地区发生较大规模的暴发或流行,造成了严重的危害。新发传染病还给发展中国家和地区的畜牧业和旅游业造成毁灭性打击,造成极大的经济损失,而且还导致人类的生存环境遭受新一轮严重污染,使地球生态环境进一步恶化。可以说,这将是新世纪人类所面临的最大的威胁与挑战之一。
随着我国对外开放的不断深入、自然和社会环境的巨大变化,一些新发传染病已在中国出现并造成流行,例如艾滋病、SARS、禽流感、莱姆病、登革热、埃立克体病等。中国还存在其他新发传染病传入的可能,包括埃博拉、西尼罗、尼帕等,因此我们必须重视和加强对新发传染病的预防、诊断、治疗和控制。
二、新发传染病病原体的实验室诊断流程路线图
新发传染病的诊断除了紧密结合临床之外,非常重要的是实验室诊断。实验室诊断常规检测一般需要进行血常规检验、血液生化检验、血气分析,另外需要进行免疫学检测抗原和抗体,分子生物学检测病原体RNA或DNA,细胞培养分离患者标本进行病原体鉴定。针对主要的不同病原体种类,其实验室诊断方法主要归类为以下一些方法。
1.病毒
病毒能引起各种感染和严重传染病,在临床微生物感染中,由病毒引起者约占3/4,并且传染性强,传播迅速,流行广泛,病死率高,后遗症严重。根据致病器官与系统,主要有呼吸道病毒、肠道病毒、肝炎病毒、疱疹病毒、黄病毒、反转录病毒、其他病毒与朊粒。病毒的诊断方法主要有病毒培养与鉴定、形态学检测、病毒抗原和核酸成分检测、抗体检测等。对病毒的分离与鉴定是病原学诊断的金标准。由于病毒是严格细胞内寄生,培养需要在活细胞内寄生,而且耗时较长;由于现有条件限制,有些病毒至今也难于培养。通常会采用以下方法进行病原体的快速诊断:形态学采用电镜观察病毒颗粒、光学显微镜观察包涵体;检测病毒成分的抗原和核酸物质,采用酶联免疫吸附试验ELISA、免疫荧光法IF、放射免疫法RIA、免疫印迹法WB检测病毒抗原成分,采用核酸电泳、核酸杂交、PCR、基因芯片和测序检测病毒的核酸物质;检测抗病毒抗体主要有ELISA、 RIA、IF和WB方法 (图1-2-1)。
图1-2-1 病毒的实验室诊断流程路线图
2.细菌
根据权威的伯杰细菌分类系统,细菌分类为革兰阳性球菌、革兰阴性球菌、肠杆菌科、革兰阴性杆菌、弧菌科、弯曲菌与螺杆菌、需氧革兰阳性杆菌、棒状杆菌属、分枝杆菌属、放线菌属与诺卡菌属、厌氧菌、螺旋体、支原体、衣原体和立克次体。细菌的实验室诊断方法主要有形态学检查、细菌培养和鉴定,另外是非培养检查方法。细菌具有相对恒定的形态和结构,了解细菌的形态与结构,对鉴定细菌、防治细菌感染以及进行有关研究具有重要意义,因此细菌的形态学检查是极为重要的基本诊断方法之一,包括不染色标本检查法和染色标本检查法。绝大多数情况下,只有通过细菌培养和鉴定才能对细菌感染性疾病进行病原学诊断,细菌培养对疾病的诊断、预防和治疗具有重要作用。其他细菌性病原学检查方法主要有免疫学方法和分子生物学检测方法,免疫学方法检查细菌抗原或抗细菌抗体。分子生物学方法临床上采用的方法多样,例如采用核酸杂交鉴定标本中有无病原菌基因,采用PCR方法检测敏感性太低或培养困难、时间过长的病原体核酸和毒素,采用生物芯片技术准确、快速、大信息量检测细菌、蛋白质、DNA以及其他生物组分。采用细菌毒素试验检测内毒素、外毒素,最后动物试验也是临床细菌学检测的重要组成部分 (图1-2-2)。
图1-2-2 细菌的实验室诊断流程路线图
3.真菌
真菌自成一界,为真核细胞型微生物,有典型的细胞核。其细胞壁含有几丁质和β-葡聚糖,有完善的细胞器,能进行有性繁殖和 (或)无性繁殖。真菌在自然界分布极为广泛,大多对人无害。对人致病的真菌分为四类:病原性真菌、条件致病性真菌、产毒真菌及致癌真菌。真菌病发病率近年来有明显上升趋势,尤其是条件致病性真菌感染更为常见,与当前临床上滥用抗生素和 (或)常用激素、免疫抑制剂、抗癌药物导致机体免疫功能下降有关。真菌种类目前有记载的真菌有10万以上,对人致病的有400种左右。按照其侵犯人体组织和器官的不同,临床上将真菌分为浅部真菌和深部真菌两大类。浅部真菌主要侵犯机体皮肤、毛发和指 (趾)甲,临床上最多见的为皮肤癣真菌。深部感染真菌能侵袭深部组织、内脏及全身,主要有假丝酵母菌、隐球菌、曲霉菌、毛霉菌、组织胞浆菌和耶氏肺孢子菌。目前临床上大多数真菌的鉴定,仍是以形态学 (包括真菌种类形态、菌落形态)检查具有重要意义,包括直接显微镜检查法和染色标本检查法。另外的真菌直接检查方法是采用免疫学方法检测真菌抗原,常用方法有乳胶凝集试验和ELISA快速检测隐球菌多糖荚膜抗原、乳胶凝集试验检测白假丝酵母菌甘露聚糖抗原、半定量放射免疫测定法等。真菌培养是目前鉴定真菌的唯一方法,其他非培养真菌检测方法有核酸检测、真菌毒素试验和动物试验,而目前临床上早期快速诊断真菌的方法是快速检测体液中真菌1-3-β-D-葡聚糖含量 (图1-2-3)。
图1-2-3 真菌的实验室诊断流程路线图
三、新发传染病实验室诊断的标本采集、运送和基本处理流程
(一)病毒实验室检测标本的采集、运送和基本处理流程注意事项
1.标本采集
应在感染早期即发病1~2天内采集,病程初期或急性期的标本中病毒含量较多,检出率较高。其次要根据感染部位尽量采集含有感染组织的标本,例如呼吸道感染常采集痰液或鼻咽洗漱液,肠道感染采集粪便,颅脑感染抽取脑脊液,出疹性疾病采集疱疹内积液标本,病毒血症采集血液。
2.标本采集须无菌操作
盛放标本的容器、采集器和运送培养基应预先进行无菌处理并贴上条码号或标签,对污染标本 (粪便、痰液等)预先用高浓度抗生素处理过夜,必要时须加抗真菌药物处理,然后再进行分离培养。
3.标本采集后须及时送检
病毒在室温中容易灭活,标本采集后应低温保存并迅速送检,最佳送检时机在标本采集后1~2小时送达实验室,血清标本如不及时检测,须标记好患者基本信息后于-20℃环境保存。如需运送标本,应将标本放入盛有冰块或低温材料的保温器具内冷藏,送检组织等标本放入含有抗生素的50%甘油缓冲液或二甲基亚砜DMSO中低温冷藏,不能立即检测的应于-70℃环境保存。
4.血清学检查的标本
对于抗病原体抗体IgG应分别在发病初期和恢复期采集双份血清,并比较双份血清抗体效价,当恢复期血清效价比初期升高4倍或以上,才具有诊断意义。
(二)细菌实验室检测标本的采集、运送和基本处理流程注意事项
1.标本采集时机恰当
应在感染早期、急性期或症状典型时,须在使用抗菌药物之前采集,因为此时标本中细菌含量较多,检出率较高。
2.须无菌操作
盛放标本的容器、采集器和运送培养基应预先进行合适的无菌处理,并贴上条码号或标签。在采集血液、脑脊液、胸腔积液、关节液等无菌部位标本时,应注意对局部及周围皮肤的消毒,严格无菌操作。对于从正常菌群寄生部位采集的标本,明确检查的目的菌,分离培养时须采用特殊的选择性培养基。
3.根据培养方法的不同采用合适的方法采集标本
厌氧培养、需氧培养或兼性厌氧菌培养、L型细菌培养检测细菌种类有所不同,采用不同的培养方法,相同类型标本,可能通过不同的采集部位来获得合适的检测标本。
4.采集适量标本
在不同时机采集具有代表性的标本,甚至是不同部位的标本。
5.采集标本时须防治污染,也要注意生物安全,防止传播和自身感染。
6.所有采集的标本均需严格进行质量控制,对不符合要求标本,临床诊断实验室应拒收。
(三)真菌实验室检测标本的采集、运送和基本处理流程注意事项
1.标本采集类别
可以采集皮肤的角质性物质、各种分泌物和排泄物、血液和体液、脓汁和渗出物。
2.标本采集要合适
浅部和深部不同真菌感染应采集不同的临床标本。
3.标本采集时机恰当
一般真菌检测标本须在用药前采集,对已用药物者须停药一段时间后再采集。
4.须严格无菌操作
整个采集过程须严格无菌操作,尤其在采集血液和脑脊液等无菌部位标本时,应注意对局部及周围皮肤的消毒,避免污染杂菌。
5.采集的标本须立即送检,尤其深部真菌标本采集后不能超过2小时。
四、新发传染病实验室基本检验项目的标本采集要求
详见表1-2-2~表1-2-8(供参考)。
表1-2-2 临床检验标本采集要求
续表
表1-2-3 临床化学检验标本采集要求
续表
表1-2-4 临床免疫检验标本采集要求
续表
续表
表1-2-5 临床基因扩增检验标本采集要求
表1-2-6 临床微生物检验标本采集要求
续表
续表
续表
注: ∗1/d表示一天中仅需送检一次,无需多次重复送检相同标本
表1-2-7 厌氧菌标本采集特殊要求
注: ∗1/d表示一天中仅需送检一次,无需多次重复送检相同标本
表1-2-8 结核标本采集特殊要求
主要参考文献
[1]倪语星,尚红.临床微生物学检验.第5版.北京:人民卫生出版社,2012.
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