第六节　溶血性贫血检查

临床上导致溶血性贫血(hemolytic anemia，HA)的病因有很多，通过实验室检查首先要确定是否为溶血性贫血，其次是明确溶血性贫血的病因。溶血性贫血的实验室检查项目多，具体详见表2-32，其中网织红细胞计数见本章第一节，下面介绍临床上较为常用或较为重要的血液学检查项目。

一、血浆游离血红蛋白测定

【测定原理】

血浆游离血红蛋白(plasma free hemoglobin)测定包括联苯胺法和氯丙嗪法，以前者多用。由于联苯胺有致癌作用，现多改用邻-甲联苯胺法，其原理为:血红蛋白中亚铁血红素具有类似过氧化物酶活性，在酸性(pH 1. 5)环境中能催化过氧化氢，氧化邻-甲联苯胺，产生颜色(在435nm处有吸收峰)，颜色的深浅与血红蛋白浓度成正比。

【标本要求】

1.抽取全血2. 0ml加到事先置有肝素(含0. 02ml的1g/L烘干)的试管中，颠倒混匀2～3次，立即送检。也可用血清代替血浆进行测定。

2.送检的标本不应有凝血或溶血，以免出现假阳性结果。

3.所用的容器应清洁，避免血红蛋白污染。

【结果报告】

以游离血红蛋白含量(mg/L)的形式报告结果。

【参考范围】

正常人＜40mg/L。

【临床意义】

发生急性血管内溶血时，血浆游离血红蛋白显著增加;珠蛋白生成障碍性贫血、自身免疫性溶血性贫血、多数血管外溶血等，血浆游离血红蛋白含量轻度增加或正常。

【应用评价】

本试验简便易行，是溶血的常规筛选检验方法之一。它具有敏感、特异性不高的特点，如肌红蛋白和其他一些具有过氧化物酶活性的物质，可使结果出现假阳性;如果血浆或血清中有残留红细胞或存在溶血，也可使结果出现假阳性，因此标本一定要避免采集引起的溶血，离心需严格，不能有红细胞残留在血浆或血清中;该试验敏感度不如结合珠蛋白(Hp)，因为当血浆内游离血红蛋白量超过Hp的结合能力时，该指标才会增加。

二、血清结合珠蛋白测定

【测定原理】

血清结合珠蛋白(haptoglobin，Hp)的测定原理包括电泳法、免疫比浊法等，目前主要采用后者。其原理为:在待测血清中加入一定量的抗血清结合珠蛋白抗体，使之与待测血清中的结合珠蛋白形成抗Hp-Hp复合物，用比浊仪测量其散射光吸光度或透光度的变化，并与标准进行比较，计算出待测标本中Hp的含量。

【标本要求】

1.常规抽取静脉血2. 0ml，不需抗凝。标本在体外保存，对结果的测定是否有影响文献报告不太一致，故最好立即送检。

2.注意所送检的标本不应有溶血，以免影响测定结果。

【结果报告】

结果用g/L的形式报告结果。

【参考范围】

正常人0. 16～2. 00g/L。

【临床意义】

1.下降

见于各种溶血，尤其是血管内溶血。严重的肝脏疾病、先天性无结合珠蛋白血症、传染性单核细胞增多症等也可明显下降。

2.增加

Hp是急性时相反应物的一个指标，可见于创伤、感染、妊娠、恶性肿瘤、系统性红斑狼疮等。

【应用评价】

本试验敏感性高。各种原因引起的溶血发生后，只要存在游离血红蛋白的释放，结合珠蛋白即可出现消耗性下降。从这一点来说可以认为结合珠蛋白减低是判断溶血存在的确诊依据。但是Hp下降可见于其他疾病，且有些疾病也可导致其增加，所以Hp下降不一定存在溶血，正常也不能排除某些疾病合并溶血的可能性。测定血清结合珠蛋白有多种方法，散射比浊法的重复性佳、特异性好、易于自动化且不必制备血红蛋白液等而被普遍采用。临床上血清结合珠蛋白测定经常与游离血红蛋白和尿Rous试验同时进行，用于确定溶血及溶血部位，尤其是血管内溶血的诊断。

三、尿含铁血黄素试验

【测定原理】

尿含铁血黄素试验又称Rous试验(Rous test)，测定沉积于肾小管上皮细胞中的铁。当血中游离血红蛋白在肾脏滤过并重吸收时，其部分铁离子以含铁血黄素的形式沉积于上皮细胞，并随着细胞脱落而随尿液排出。其原理为:尿沉渣中上皮细胞内的Fe3 +，在酸性环境下能与亚铁氰化钾产生蓝色的亚铁氰化铁(普鲁士蓝)沉淀，在显微镜下观察上皮细胞内有否蓝色颗粒。

【标本要求】

1.新鲜尿液10ml (由于要求尿液中有一定数量的上皮细胞，故最好是晨尿)，标本采集后应在半小时内送检。

2.盛尿液的容器应清洁，防止铁剂污染，否则易致假阳性结果。

3.该方法所需的试剂(亚铁氰化钾和酸性亚铁氰化钾)须新鲜配制，其中亚铁氰化钾较难溶解，所以标本送检时应考虑到该项目测定所需要的时间，提前与实验室联系，以免送检的标本无法及时测定。

【参考值】

正常人阴性。

【临床意义】

Rous试验阳性说明尿中有铁排出，提示患者存在着慢性血管内溶血，因此它是诊断慢性血管内溶血的较好指标。患者无论有无血红蛋白尿，只要有慢性血管内溶血存在，就可以出现阳性，并持续存在数周。在急性溶血初期(数天内)虽然有血红蛋白尿，但脱落的上皮细胞内尚未形成可以测定到的尿含铁血黄素，此时本试验可为阴性。临床上如果Rous试验呈持续阳性，对阵发性睡眠性血红蛋白尿症的诊断具有重要意义。

【应用评价】

由于结果观察是查找上皮细胞内、外有无立体感的、闪光的、分散或成堆的蓝色颗粒，故要求尿液中有一定数量的上皮细胞，否则易致假阴性。同时由于标本、试剂、容器等容易被铁污染，所以观察结果时应注意排除假阳性，如果是在上皮细胞内发现阳性颗粒，其结果可靠些。由于结果存在着假阳性和假阴性的可能，所以要求同时做正常对照。

四、红细胞渗透脆性试验

【测定原理】

红细胞渗透脆性试验(red cell osmotic fragility test，ROFT)是将红细胞置于一系列低渗氯化钠溶液中(详见表2-33)，水分透过细胞膜进入红细胞内而使之胀大，导致红细胞破坏、发生溶血，观察溶血情况即可判断红细胞渗透脆性。红细胞的抗低渗能力与红细胞的表面积(S)和红细胞体积(V)之比有关:

S/V↑——说明抗低渗能力越强，红细胞渗透脆性越小。

S/V↓——说明抗低渗能力越弱，红细胞渗透脆性越大。

【标本要求】

1.标本宜用新鲜、不加任何抗凝剂的静脉血，所以要求直接进行现场试验。万不得已时，可用肝素抗凝血(含0. 02ml的1g/L肝素，烘干试管)，采静脉血1. 0ml (现场采血或标本采集后立刻送检)，但标本中不应有凝血或溶血。

2.该试验中的低渗氯化钠溶液需临时配制，并且在加入全血后需静置2小时后才能观察结果，所以标本送检时需考虑到该项目测定所需要的时间，以免送检的标本无法及时测定。

【结果报告】

上清液出现透明红色、管底有红细胞沉淀者为开始溶血管，此管氯化钠浓度即为开始溶血浓度;上清液透明红色、管底无红细胞沉淀者为完全溶血管，此管氯化钠浓度即为完全溶血浓度。结果报告:开始溶血及完全溶血管的氯化钠浓度(%)，并以同样的方式报告正常对照结果。

【参考范围】

正常人开始溶血: 0. 44%～0. 48 % (即4. 4～4. 8g/L) ;完全溶血: 0. 28%～0. 32 % (即2. 8～3. 2g/L) ;患者与正常对照溶血管的氯化钠浓度相差0. 04% (0. 4 g/L)才具有诊断价值。

【临床意义】

主要用于初步筛选患者是否有膜缺陷性溶血性贫血。

1.红细胞渗透脆性增加

见于遗传性球形红细胞增多症、椭圆形红细胞增多症、自身免疫性溶贫伴有球形红细胞增多、口形红细胞增多症(水肿型)等。

2.红细胞渗透脆性下降

①珠蛋白生成障碍性贫血、缺铁性贫血、铁粒幼细胞贫血等，系血红蛋白合成减少所致;②严重肝病患者，棘形红细胞增多导致红细胞表面积增加;③阻塞性黄疸(包括肝病伴肝内胆汁淤滞)时，由于血浆脂类异常，游离胆固醇及磷脂一起进入红细胞膜，使膜脂质增多，膜面积绝对性增大;④脾切除术后，没有了对红细胞膜的摘除作用，使红细胞表面积比正常人多。

【应用评价】

1.该试验简单实用，但影响因素较多，故每次试验应同时做正常对照。

2.红细胞渗透脆性增加的程度与球形红细胞的数量有关，约20%～25%患者因缺乏典型的球形红细胞者本试验正常或轻度增加，但孵育后脆性常增加。所以该试验敏感性较差，结果正常不能排除膜缺陷性溶血性贫血的可能性，需结合其他实验室检查，进行综合分析。

3.严重贫血、严重黄疸的患者，常影响结果判断，因此需将标本配成50%红细胞悬液后再进行试验。

4.为适应群体普查的需要，红细胞渗透脆性试验还设计了更简便的方法，即一管法，即观察红细胞在0. 32%或0. 36%的氯化钠溶液中的溶血情况。

五、蔗糖溶血试验

【测定原理】

蔗糖溶血试验(sucrose hemolysis test)的原理是:等渗、低离子强度的蔗糖溶液可增加补体与红细胞膜的结合。阵发性睡眠性血红蛋白尿症(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH)患者体内存在补体敏感红细胞，与蔗糖溶液共同孵育后，红细胞膜上形成小孔，蔗糖水进入红细胞，引起红细胞膜破裂而发生溶血。

【标本要求】

1.109mmol/L枸橼酸钠1∶9抗凝血至少1ml。因为标本要求新鲜，所以采血后应尽快送检。

2.所送检的标本不应有凝血或溶血，以免影响测定结果。

3.所用器具必须洁净干燥，以免溶血造成假阳性。

【结果报告】

37℃水浴30分钟后，如上清液呈红色(即溶血)为阳性，上清液呈无色透明(即无溶血)为阴性。所以本试验以阴性、阳性的形式报告结果。

【参考值】

正常人阴性。

【临床意义】

PNH患者该试验为阳性;巨幼细胞贫血、再生障碍性贫血、遗传性球形红细胞增多症、自身免疫性溶血性贫血等偶尔也可阳性。

【应用评价】

本试验对实验条件要求不高，在临床上易开展。其敏感性较高，但特异性不高，只能作为PNH的筛选项目，常与Ham试验同时做。

六、酸溶血试验

【测定原理】

酸溶血试验(acid hemolysis test)又称Ham试验，其原理是:阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)患者的红细胞由于存在膜缺陷，导致红细胞对补体敏感性增加，特别在弱酸性(pH 6. 4～6. 5)条件下，易破坏而发生溶血。其操作详见表2-34，但由于比较烦琐，临床上常用简易法代替，详见表2-35。

【标本要求】

标本不宜用抗凝血，因为抗凝剂中的钾、钠离子可影响pH，阻碍溶血，降低敏感性，出现假阴性，故常用去纤维蛋白血。去纤维蛋白血制备如下:采静脉血2.0ml置入试管中，用玻璃珠或竹签搅拌10分钟即可(注意动作轻柔，否则易导致红细胞大量破坏)。此标本用于患者红细胞悬液的制备。

【结果报告】

各管按表2-34操作后，置37℃水浴中温育1小时后，离心观察上清液，上清液呈红色表明有溶血。如果第2管有明显溶血，第1管有轻度溶血，而第3～6管均无溶血，报告为Ham试验阳性。简易法中，如果测定管溶血，对照管无溶血，也报告为阳性。

【参考值】

正常人阴性。

【临床意义】

阳性结果主要见于PNH患者，但某些自身免疫性溶血性贫血发作严重时也可阳性。

【应用评价】

本试验特异性较高，敏感性较好，经常作为PNH的确诊试验。但若患者经多次输血，血中异常红细胞相对减少，可造成本试验弱阳性或假阴性结果。如果血清中补体不足，也会产生假阴性的结果。诊断PNH，最好用流式细胞术对CD55、CD59及Flaer进行测定。

七、CD55、CD59及Flaer测定

【测定原理】

阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)是一种获得性造血干细胞基因突变引起的溶血性贫血，其患者血细胞膜上的糖化磷脂酰肌醇(glycophosphatidyl-inositol，GPI)完全或部分缺失，使膜上的两种锚连蛋白:衰变加速因子(decay accelerating factor，DAF，CD55)和反应性溶血膜抑制物(membrane inhibitor of reactive lysis，RIRL，CD59)等不能结合在膜上，导致PNH细胞对补体敏感性增加，使血细胞更易发生以补体介导的血管内溶血。利用荧光素标记的抗CD55、抗CD59单克隆抗体与血细胞膜上对应的抗原分子结合，以流式细胞术检测红细胞膜或白细胞膜上CD55 +、CD55－、CD59 +、CD59－抗原分子的表达量，从而反映血细胞膜表面是否存在锚连蛋白的缺失。

Flaer是Alexa-488标记的无活性嗜水气单胞菌溶素前体的变异体，它可以特异性结合于白细胞膜上GPI锚连蛋白，该标记物可以被激发出绿色荧光，用流式细胞仪检测可以区分GPI锚连蛋白阴性(GPI－)细胞和GPI锚连蛋白阳性(GPI +)细胞。

【标本要求】

外周血与骨髓标本均可用以检测，从早期诊断角度看，采用骨髓标本可能更早检出PNH克隆细胞，但骨髓中成分复杂，早期细胞较多，并不是理想的检测标本，故临床一般采用外周血标本，并推荐使用EDTA抗凝血(每管含1. 0mg/ml EDTA 20μl)，但也可用肝素或枸橼酸钠抗凝。标本采集后建议在24～48小时内进行检测，超过24小时者保存于4℃，其中红细胞受时间影响较小(4℃可保存7天)，而白细胞的散射光和抗原表达随时间变化会有所不同。

【结果报告】

正常人红细胞与白细胞膜上均有CD55、CD59表达，而PNH患者由于锚连蛋白的完全或部分缺失，表现出CD55、CD59阴性或部分阴性。临床上将PNH克隆分为三型:①Ⅰ型:指对补体敏感度正常，CD55、CD59完全阳性表达;②Ⅱ型:指对补体中度敏感，CD55、CD59部分阳性表达;③Ⅲ型:指对补体高度敏感，CD55、CD59完全阴性表达。Flaer目前尚不能用于红细胞膜上锚连蛋白的检测，而只用于白细胞的检测。正常人Flaer呈100%阳性，而PNH患者呈阴性或部分阴性。

临床上常用报告方式有以下两种:①红细胞与粒细胞的CD55 +、CD59 +群体百分率;②红细胞与粒细胞的CD55－、CD59－群体百分率。不过推荐使用阴性百分率报告。使用Flaer检测时，常同时报告红细胞CD59－、粒细胞Flaer－、单核细胞Flaer－群体百分率，而不建议使用阳性群体百分率。

【参考范围】

到目前为止，尚无统一的参考范围。大多数认为正常人红细胞、粒细胞上CD55－、CD59－群体百分率应＜5%;也有人认为粒细胞上CD55－、CD59－＜10%亦可; Flaer－群体百分率也未见统一的参考范围，目前认为应＜1%～2%。

【临床意义】

见于阵发性睡眠性血红蛋白尿症、再生障碍性贫血-阵发性睡眠性血红蛋白尿症(AA-PNH)综合征患者等。

【应用评价】

CD59和CD55同时部分缺失或完全缺失是典型的PNH，单独一个完全缺失需除外先天性单个CD分子缺乏，因此至少需检测两种GPI锚连蛋白。CD59的敏感性高于CD55，在搭配其他锚连蛋白检测时，可不再检测CD55。在观察PNH分型时，红细胞CD59检测优于粒细胞的检测，但严重溶血、反复输血可能造成红细胞PNH克隆所占比例明显减少而难以检出，而粒细胞上CD55、CD59表达缺陷出现较早，检测敏感度优于对红细胞检测，可在Ham试验阳性之前出现，具早期诊断PNH的价值，且不受输血因素的影响。因此，临床上往往同时检测红细胞、粒细胞上的CD59、CD55。

Flaer检测PNH有很高敏感性，能精确分析Ⅱ型、Ⅲ型细胞;对于检测CD55、CD59不能确诊的病例，可结合Flaer检测得以确诊;对于部分免疫性血细胞减少症患者中因自身抗体覆盖锚连蛋白造成的假性PNH克隆也可通过Flaer与系列标记单抗得以区别。目前Flaer检测仅适于白细胞检测，在部分患者有核细胞数量明显减少时，可能难以获得足够数量的异常粒细胞、异常单核细胞用以分析。因此Flaer与抗锚连蛋白抗体(如抗CD59)联合检测能提高PNH检测的准确度、敏感度与适用范围。

尽管本试验有助于发现一些早期或即将发展为PNH的病例，但该试验结果只是提示有异常细胞存在，由于有研究显示在骨髓增生异常综合征、再生障碍性贫血甚至正常人都可有少量类似PNH的锚连蛋白缺失的血细胞，但它们不会如PNH克隆细胞呈现优势生长，因而诊断PNH还需综合分析和密切追踪观察才能下结论。

八、红细胞膜蛋白电泳

【测定原理】

红细胞膜蛋白电泳(erythrocyte membrane protein electrophoresis)的方法包括SDS-PAGE (十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)法和毛细管电泳，两者原理基本相同。膜蛋白质在含十二烷基磺酸钠(SDS)溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，电泳时蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。当分子量在15～200kD之间时，蛋白质分子的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式: logMW = K－bX (式中MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数)，若将已知分子量的标准蛋白质迁移率对分子量作对数图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。利用合适的洗脱液分离后，再结合其他技术，可进行各种膜蛋白成分的鉴定及定量分析。

【标本要求】

109mmol/L枸橼酸钠溶液1∶9抗凝的新鲜全血3～5ml，以当日测定为佳。

【结果报告】

以每种组分的相对百分含量来报告，多与正常红细胞膜蛋白电泳图谱作比较，或以带3蛋白为基准，以各膜蛋白含量与带3蛋白的比例表示。

【参考范围】

正常人红细胞膜蛋白经SDS-PAGE法电泳后分成8个主要区带，包括1、2、3、4、5、6、7带，其中第4带又分为若干个小带，且4. 1、4. 2与4. 5、4. 6相距较远，故肉眼看，为8个区带。另外，第2区带也有小带出现，但是距离比较接近，肉眼较难区分。由于实验室采用的电泳条件不同，参考值也不尽相同，各实验室可根据自己的条件制订参考值。通常认为，带3蛋白约占膜蛋白总量的25%。

【临床意义】

遗传性膜缺陷性溶血性贫血常有红细胞膜蛋白的异常。如遗传性球形红细胞增多症(HS)患者80%以上有膜蛋白的缺陷，包括膜收缩蛋白单独缺乏、锚蛋白与收缩蛋白联合缺乏、区带3蛋白缺乏等。遗传性椭圆形红细胞增多症(HE)患者可有4. 1蛋白缺乏或迁移异常、膜收缩蛋白缺乏以及分子量异常的膜收缩蛋白α链或β链等。红细胞膜蛋白电泳对膜异常疾病与其他疾病(尤其是Coombs试验阴性的自身免疫性溶血性贫血)鉴别诊断也有意义。

【应用评价】

对膜蛋白的分析，临床上也采用放射免疫法或ELISA法直接测定含量，但若能测定膜蛋白的基因变异，则更具有特异的诊断价值。

九、自身溶血及纠正试验

【测定原理】

自身溶血及纠正试验(autohemolysis and correction test)，是测定患者全血在37℃孵育48小时后而自发产生溶血的程度。由于患者红细胞酶缺陷使ATP生成不足或膜异常，使红细胞在自身血清中经温育后逐渐发生溶血，称为自身溶血试验。如果加入ATP或葡萄糖，观察溶血是否被纠正，称为纠正试验。

【标本要求】

1.一切用具要干燥，避免产生溶血，并应无菌操作。

2.要求进行现场抽血5ml，分装在4支小试管中。每小管事先加1g/L肝素0. 02ml，8磅15分钟高压灭菌，烘干。

【结果报告】

按表2-36操作后，计算测定管、ATP纠正管及葡萄糖纠正管的溶血率，以测定管溶血率计算作为例子:

结果报告形式为:加等渗盐水溶血率##. #%，加葡萄糖溶血率##. #%，加ATP溶血率##. #%。

【参考范围】

正常人血液在无菌条件下孵育48小时后，溶血率很低，一般＜4. 0%，加葡萄糖或ATP后，溶血率更低，其他各类溶血性贫血结果详见表2-37。

【临床意义】

HS自身溶血加快，能被葡萄糖、ATP纠正。遗传性非球形红细胞溶血性贫血自身溶血增加，其中Ⅰ型主要见于葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺陷症，溶血能被葡萄糖和ATP纠正;Ⅱ型主要见于丙酮酸激酶(PK)缺陷症，溶血不能被葡萄糖纠正，但能被ATP纠正。阵发性睡眠性血红蛋白尿症、自身免疫性溶血性贫血和药物性溶血等也呈Ⅱ型溶血结果。

【应用评价】

本试验有助于遗传性球形及非球形红细胞溶血性贫血的鉴别诊断。但由于操作复杂、耗时长(37℃孵育48小时)、用血量大(5ml)，本试验影响因素多，敏感性和特异性均不高，故现临床很少开展。

十、变性珠蛋白小体生成试验

【测定原理】

在血液中加入氧化还原染料煌焦油蓝，在37℃中孵育一定时间后，不稳定血红蛋白可被氧化而形成变性珠蛋白小体(Heinz body)，并被染成蓝色。在10分钟、1小时及24小时时，分别推成血涂片，观察显微镜下红细胞内变性珠蛋白小体形成情况，来判断红细胞内是否存在稳定性下降的血红蛋白。

【标本要求】

现场采末梢血或静脉血数滴。

【结果报告】

计数500～1000个红细胞，报告含变性珠蛋白小体(即Heinz小体)的红细胞阳性率。

【参考范围】

正常人含5个以上Heinz小体的红细胞＜30%。G6PD缺陷症患者常＞45%。

【临床意义】

变性珠蛋白小体阳性率增加主要见于HbH病、G6PD缺陷症、不稳定血红蛋白病，其他如谷胱甘肽(GSH)缺陷、苯类化学药物中毒等也可见增加。HbH病患者红细胞中能较快形成小体(一般在10分钟至1小时内)，可达50%以上，这种小体通常呈点状、圆形、较多且弥散分布红细胞内，又称HbH包涵体检查。其他不稳定血红蛋白往往需要更长时间(3小时或更长些)，而且这种小体往往更粗大些，量少，多分布于细胞边缘。

【应用评价】

本试验的特异性较差，只可作为G6PD缺陷症和不稳定血红蛋白病等的筛选试验，诊断上述疾病均需做进一步的确诊试验。检查变性珠蛋白小体的试验从广义上来说，包括Heinz小体生成试验及HbH包涵体生成试验，其实两者为同一性质的不同表现形态，所以此处将两者合在一起介绍。因本试验与网织红细胞染色的原理基本相同，计数Heinz小体时应注意与网织红细胞区分，否则将导致阳性率增加而影响结果的准确性。而且制片后应及时计数，涂片存放过久会导致包涵体消失。

十一、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性测定

【测定原理】

葡萄糖-6-磷酸(G6P)在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD)作用下形成6-磷酸葡萄糖酸(6PGA)，同时使氧化型辅酶Ⅱ(NADP)转变为还原型辅酶Ⅱ(NADPH)，后者在340nm波长紫外线照射下产生荧光，用紫外分光光度法测出每分钟吸光度增加的平均值，根据单位时间内NADPH生成的量来计算G6PD活性。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性定量测定由于所用试剂及体系的不同，有以下几种方法:①WHO推荐的Zinkham法;②ICSH推荐的Glock与McLoan法;③NBT定量法;④Chapman和Dern法等。临床常用前三种方法。

【标本要求】

EDTA (每管含20μl 1. 0mg/ml EDTA)或肝素(每管含0. 02ml的1g/L肝素，烘干)抗凝血2ml均可。若在4℃保存，可以稳定一周，但最好在48小时内测定完毕。

【结果报告】

单位定义:根据每升血液每分钟催化1μmol 的NADPH为1国际单位(IU)，换算成每克血红蛋白的G6PD酶活性。

【参考范围】

①Zinkham法: (12. 01±2. 09) IU/g Hb (37℃) ;②Glock与McLoan法: (8. 34±1. 59 ) IU/g Hb (37℃) ;③NBT定量法: (13. 1～30. 0) NBT单位;④Chapman和Dern法: (2. 8～7. 31) IU/g Hb (25℃)。

【临床意义】

G6PD活性下降见于G6PD缺陷症患者。一般来说，患者测定值较正常平均值下降40%以上即可做出诊断。

【应用评价】

该试验能准确地测定G6PD活性，属确诊试验，在临床上也较容易开展，所以临床上该试验是确诊G6PD缺陷症的最主要实验室测定手段。若在急性溶血期，如果G6PD活性测定结果正常而又高度怀疑为G6PD缺陷症，应采取下列措施以确定是否存在G6PD活性下降:①急性溶血后2～3个月复查G6PD酶活性;②低渗处理红细胞后测定G6PD活性;③将全血高速离心沉淀后，取底层红细胞测定G6PD活性。如果G6PD活性明显下降，则诊断为G6PD缺陷症。如果在溶血发作期输注了红细胞，G6PD活性水平会增加;新生儿或高网织红细胞的标本，也会高些。由于影响因素较多，所以最好同时作阴性对照和阳性对照。

十二、异丙醇沉淀试验

【测定原理】

异丙醇属非极性溶剂，它可使正常血红蛋白分子中的氢键结构减弱、稳定性下降，导致血红蛋白沉淀，而不稳定血红蛋白能很快的沉淀，所以称为异丙醇沉淀试验(isopropanol precipitation test)。通过观察血红蛋白液中沉淀出现的时间来判断患者血中是否存在不稳定血红蛋白。

【标本要求】

肝素(每管含0. 03ml的1g/L肝素，烘干)或枸橼酸钠抗凝新鲜血3. 0ml，制成10%血红蛋白液。

【结果报告】

结果以阴性、阳性的形式报告，阳性可分为强阳性和弱阳性。如果5分钟内出现浑浊，20分钟出现大块沉淀为强阳性;如20分钟内出现浑浊，40分钟内出现绒毛状沉淀为弱阳性;如40分钟时仅稍浑浊而无沉淀者为阴性。正常对照血红蛋白在40分钟时应无沉淀。

【参考值】

正常人为阴性。

【临床意义】

本试验阳性常提示不稳定血红蛋白病，且多为强阳性;而HbH、HbF、HbE等也可出现阳性，但多为弱阳性。

【应用评价】

本试验是测定不稳定血红蛋白的敏感试验，但特异性不高。本法影响因素较多，各项试验条件要严格控制，否则易出现假阳性，有时也出现假阴性。例如标本放置过久、出现高铁血红蛋白，可导致假阳性;试剂配制后放置过久，易出现假阴性。所以每次最好用脐血作阳性对照，并同时做正常对照。

十三、血红蛋白电泳

【测定原理】

血红蛋白电泳(hemoglobin electrophoresis)是根据不同的血红蛋白等电点不同，在一定pH缓冲液及电压作用下，各种血红蛋白的电泳方向和速度不同，因此分出各自的区带。如果肽链上氨基酸发生替换、缺失或正常肽链的异常聚合(γ4、β4等)，使分子表面电荷变化而影响泳动速度。故通过血红蛋白电泳可以发现大部分的氨基酸组分或分子结构异常的血红蛋白，而且通过光电扫描或区带洗脱，还可进行各种血红蛋白成分的定量分析。醋纤膜电泳图谱见图2-23。

【标本要求】

肝素或枸橼酸钠抗凝新鲜全血3. 0ml (具体见异丙醇沉淀试验)，制成10%血红蛋白液。

【结果报告】

本试验是以各种血红蛋白成分的相对含量(%)的形式报告结果。以HbA2为例，计算公式如下，其中5为HbA的稀释倍数，如果有异常血红蛋白X，那么在公式的分母中再加上异常血红蛋白X吸光度值。

【参考范围】

在pH 8. 6的条件下，正常人的电泳谱显示4条区带，从阳极端依次为HbA (量最多)，HbF、HbA2，最后为量更少的红细胞内非血红蛋白成分(碳酸酐酶——CA区带，联苯胺染色不显色)。正常成人HbA约占97%，HbA2约占2%～3%，HbF约占1%。新生儿HbF可高达31%～96%，3个月后迅速下降，2岁以后可降至成人水平。如有异常血红蛋白，则可出现异常区带。

【临床意义】

主要用于β-珠蛋白生成障碍性贫血的HbA2测定和发现异常血红蛋白。HbA2增加是β-珠蛋白生成障碍性贫血的一个重要特征之一，此外，HbA2轻度增加还见于肝病、肿瘤和某些血液病，HbA2减少可见于其他血红蛋白合成障碍性贫血。血红蛋白电泳时，除上述显示4条区带外，其他区带出现均属异常区带。1981年全国血红蛋白病会议讨论的意见将异常区带分为H、J、K、A、G、D、E七个组，参见图2-23。其中以HbA为标准，将异常Hb分为快Hb和慢Hb两部分。快Hb包括HbH、HbJ和HbK;慢Hb包括HbG、HbD和HbE; HbA区带中含有的异常血红蛋白主要是一些uHb及某些氧亲和力增加的异常Hb。

【应用评价】

血红蛋白电泳通过各种血红蛋白总电荷不同而将其区分开，是检查和鉴定异常血红蛋白的最主要而常用的方法。但是有些异常血红蛋白如不稳定血红蛋白、氧亲和力增强的异常血红蛋白以及单个氨基酸变异的异常血红蛋白等，总电荷相差极少或完全相同，电泳时无法将它们区分开，只有用多种不同的电泳和不同的支持介质、缓冲液、电泳仪等各种方法，才能从具体细节上加以鉴别。如pH 8. 6时，Hb Protland与HbA、HbF不易区分;而在pH 6. 5时，Hb Protland向阳极移动，与HbA和HbF分离。根据电泳所用支持物的不同，有琼脂糖凝胶电泳、淀粉凝胶电泳、醋酸纤维薄膜电泳、毛细管电泳等。目前，临床常用醋酸纤维素膜电泳，优点是操作简便，电泳过程短，对异常血红蛋白的分辨较敏感，便于洗脱定量分析，适宜于一般临床实验室作为异常血红蛋白过筛的电泳方法。不管采用哪种方法，均应同时做正常对照。

十四、高铁血红蛋白测定

【测定原理】

高铁血红蛋白(methemoglobin，MHb)在波长630nm处有吸收峰。当在血红蛋白液中(含有MHb)加入氰化物(KCN)后，高铁血红蛋白转变为氰化高铁血红蛋白(HiCN)，而HiCN在630nm处无吸收峰，导致630nm处的吸收峰消失。其吸光度的下降程度与MHb的含量呈一定的比例。因此测定630nm处吸光度的下降程度就可以计算出MHb的含量。

【标本要求】

该试验要求现场试验。标本取得后应在1小时内完成，否则MHb将逐渐被还原成血红蛋白，使结果偏低。采集新鲜全血0. 2ml，加到一支大试管中，加入0. 1mol/L pH 6. 8的磷酸盐缓冲液4. 0ml和非离子表面活性剂Nonidet P40或Triton X-100 6. 0ml混匀，并分成A、B两管。

【结果报告】

本法测定结果为相对百分率，如果要报告MHb (g/L)，则测定患者的总Hb (g/L)，然后乘以百分率即可。其计算公式如下:

【参考范围】

正常人为1%～3%，婴儿及吸烟者略高。

【临床意义】

MHb＞20g/L临床将出现发绀。遗传性高铁血红蛋白还原酶缺乏症、血红蛋白M (HbM)病和某些不稳定血红蛋白病，均可出现MHb血症。

【应用评价】

MHb、硫化血红蛋白(HbS)两种血红蛋白均能使患者发生发绀，且MHb的吸收峰在630nm，HbS的吸收峰在620nm，两者相距很近，不易区分。但是加入50g/L 的KCN溶液后，MHb被还原成血红蛋白，而HbS不变。利用这一原理，可以鉴别上述两种血红蛋白，有助于临床对这两种疾病的诊断。

十五、抗人球蛋白试验

【测定原理】

抗人球蛋白试验(antihuman globulin test/ Coombs test)包括直接抗人球蛋白试验(direct antiglobulin test，DAT)和间接抗人球蛋白试验(indirect antiglobulin test，IAT)，用于测定是否存在红细胞自身抗体(主要是IgG)。

1. DAT

测定红细胞表面是否吸附着不完全抗体，它可与红细胞膜结合形成抗原-抗体复合物。但因不完全抗体分子小，不能有效地连接红细胞，仅使红细胞处于致敏状态，加入抗人球蛋白血清，在致敏的红细胞之间搭桥，出现肉眼可见的凝集，即为DAT阳性。

2. IAT

测定血清中有无不完全抗体。将含有不完全抗体的待测血清加入RhO (D)阳性或与患者ABO血型抗原相同的正常人红细胞中，血清中的抗体结合到红细胞上，致敏红细胞，洗涤后加入抗人球蛋白，在致敏的红细胞之间搭桥，出现肉眼可见的凝集，即为IAT阳性。

【标本要求】

常规抽取静脉血4. 0ml，分成两份，一份用20μl 1. 0mg/ml EDTA抗凝用于DAT，另一份不抗凝用于IAT。

【结果报告】

以阴性、阳性的形式分别报告DAT、IAT结果。

【参考值】

正常人DAT阴性，正常人IAT阴性。

【临床意义】

新生儿溶血病、溶血性输血反应、自身免疫性溶血性贫血等可出现DAT阳性结果; IAT主要用于血型鉴定、输血、血制品、器官移植、妊娠所致免疫性血型抗体以及自身免疫性溶血型抗体的测定。

【应用评价】

本试验对试验条件要求不高，临床上通常均有开展。如果分别用纯化的抗IgG、IgA、IgM、C3、C4等抗血清进行直接或间接抗人球蛋白试验，还可进一步测定出自身抗体的类型。但由于红细胞上的抗体分子数量在500个以上时才有利于抗人球蛋白与不完全抗体的结合，故其敏感性不高。

十六、冷凝集素试验

【测定原理】

冷凝集综合征(cold agglutinin syndrome，CAS)的患者血清中存在冷凝集素(cold agglutinin)，为IgM类完全抗体，在低温时(0～4℃)可使自身红细胞、O型红细胞或与受检者血型相同的红细胞发生凝集。当温度回升到37℃时凝集消失。

【标本要求】

常规抽取静脉血3ml，无需抗凝，及时送检。若不能及时测定，标本须置于室温下保存，而不能置于20℃以下环境中。

【结果报告】

结果以发生冷凝集的最高稀释度(效价)报告。

【参考范围】

正常人≤1∶32。

【临床意义】

冷凝集综合征患者阳性，效价多高达1∶256甚至1∶1000以上。支原体肺炎、传染性单核细胞增多症、疟疾、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、流行性感冒、肝硬化等可引起冷凝集素效价继发性增加。

【应用评价】

本试验操作简单，在临床上易开展，但须熟练、准确。

十七、基因分析

【测定原理】

基因诊断(gene diagnosis)通过分子生物学技术来检测基因的存在，并分析基因类型、缺陷及其表达功能是否正常，来达到诊断疾病的目的。归纳起来包括核酸分子杂交法和聚合酶链反应两大类，各种具体的方法都是从这两种方法中衍生出来或互相结合而来的，主要包括:①限制性内切酶酶谱分析及内切酶片段长度多肽性(RFLP)连锁分析;②PCR产物的斑点杂交技术;③反向斑点杂交技术;④等位基因特异PCR;⑤突变引物延伸扩增技术;⑥基因芯片技术;⑦直接对DNA扩增产物进行测序;⑧RT-PCR测定mRNA等。

【标本要求】

抽取静脉血2. 0ml，用EDTA抗凝(每管含1. 0mg/ml EDTA 20μl)或枸橼酸钠抗凝(抗凝剂与静脉血的比例为1∶9)均可，不能用肝素抗凝，因为肝素是Taq酶的强抑制剂。采集血液时最好用真空采血管。血样采集后，可以将全血冷冻保存(－70℃下可长时间保存)，破碎红细胞后提取DNA，也可以在18～24小时内分离的单个核细胞中提取DNA，不过从单个核细胞制备的DNA远比从全血中提取DNA效果要好得多。如果用于RNA测定的标本，建议进行抗凝处理，并尽快(3小时以内)分离血浆，以避免RNA的降解;若未做抗凝处理，则抽血后，必须在1小时内分离血清。有条件的话，对标本做稳定化处理后再运送更好(尤其是用于RNA测定的标本)，如未经稳定化处理，则必须速冻后放在干冰中运送。

【结果报告】

直接报告某个突变基因，如HbE (β26Glu→Lys)，CD114 (CTG→CCG)，CD121 (G→T)，cDNA1367 (G→T)等均可。

【临床意义】

基因分析主要用于遗传性溶血性贫血的病因诊断。目前来说只是诊断而已，对患者本身的治疗意义并不大。但是对于产前诊断，基因分析是十分必要的，基因分析不仅从分子水平阐明该类疾病的发病机制，而且还要为实现从基因水平上诊断和治疗疾病的目标做好准备。

【应用评价】

基因诊断具有更直接、特异、敏感的特点，已经成为临床上成熟的诊断技术。为保证实验室测定结果的可靠性，需对试验的整个过程，包括标本的采集、运送、处理、用具、试验条件等标准化;对操作人员进行规范化培训;试验时进行室内、室间质量控制等均非常必要。

关于溶血性贫血的实验室检查项目比较多，由于各种各样的原因，有些临床上已经很少使用的项目，本节未将其列出。从上述提及的项目来看，此类检查还是以手工操作为主，为尽量减少试验条件及操作者的实际操作经验对试验结果的影响，一般都要求同时做正常对照，并将正常对照的结果一并报告，有利于临床医师对结果进行综合分析。

(郑美琴)