9　心脏内皮与间质的转化

心肌纤维化是许多心血管疾病进展到一定阶段后的共同病理表现，它可引起室壁顺应性降低，心室舒缩功能减弱以及心脏传导异常等，临床上表现为心脏舒张和（或）收缩功能不全、心力衰竭、心律失常，甚至猝死等。目前临床上缺乏特异性治疗心肌纤维化的满意方法，因此阐明心肌纤维化的发生及发展机制，对预防和逆转心肌纤维化，改善预后，提高心血管疾病患者的生存率和生活质量具有重要意义。

有研究表明，心肌纤维化过程涉及多种效应细胞、多种效应分子，其中最主要的效应细胞是活化了的成纤维细胞（成纤维细胞），其可分泌过多细胞外基质，并在心肌细胞间沉积，以致心脏中微循环减少，心肌正常构形破坏。参与心肌纤维化的成纤维细胞的来源尚不清楚。比较公认的观点有组织中原有成纤维细胞增殖、骨髓干细胞的增殖分化及内皮间质的转化（endothelial-to-mesenchymal transition，EndMT）。有研究证明，在小鼠心肌纤维化过程中有EndMT参与，并推测大约27%～35%的成纤维细胞来源于EndMT的内皮细胞，心肌纤维化程度减轻的同时常伴有EndMT现象减少。越来越多的研究支持EndMT与心肌纤维化之间存在着密切的联系。

一　EndMT

EndMT是指在病理或生理状态下，受某些刺激因子的作用，内皮细胞的形态、表型和功能都发生明显改变，呈现出向成纤维细胞转化的特征和过程。具体表现为：细胞内骨架蛋白重新排列，内皮细胞的外形由鹅卵石样转为长梭形，并可出现伪足；内皮细胞的特异性标志物，如血管内皮钙黏蛋白（VE-cadherin）、Tie受体1／2、血管内皮生长因子受体1／2（VEGFR1／2）、血小板内皮细胞黏附分子-1／CD31（PECAM-1／CD31）等表达逐渐减弱或丧失，转而表达活化的成纤维细胞特异性标志物，如α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、成纤维细胞特异性蛋白-1（FSP-1）、Ⅰ型和Ⅲ型胶原、波形蛋白、钙调蛋白等；同时伴有低密度脂蛋白摄取功能减弱或丧失，细胞间连接减少，细胞从血管内皮层脱离，而迁移和增殖能力增强。由于内皮细胞是一特化了的上皮细胞，EndMT与上皮间质转化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）在表现形式、诱导因素、分子机制及致纤维化作用等方面有着很多相似之处，因而可将EndMT看作是EMT的一种特殊形式。可以看出EndMT表现出的不仅是细胞的外部形态和内部结构及所在部位发生了改变，而且其表型、功能也发生了根本性的改变，而后者是改变的本质。

二　EndMT参与胚胎心脏发生过程

EndMT在胚胎心脏发育过程起到非常重要的作用，原始心管由心内膜层和心肌层构成，它们之间由一层非细胞结构的心胶质隔开，在心肌细胞及心内膜细胞时空特异性表达的各种分子（如BMP-4、msx、msx-2、TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3等）调控下，靠近房室沟和心室流出道的心内膜内皮细胞发生EndMT，侵入心胶质、发育成为心脏瓣膜以及室间隔膜部的原基，有学者用体外培养胚胎心内膜垫内皮细胞进行研究，重现出这一过程。然而在成体内，EndMT仅见于病理状态。

三　调节EndMT的相关分子

近年来关于心脏和其他器官（如肺、肾、肝、肿瘤等）的纤维化研究表明，有许多调节因子参与EndMT之中。主要有TGF-β超家族、炎性因子、微小RNA、生长因子以及蛋白酶等，如图1-9-1所示。

1.TGF-β超家族

TGF-β超家族包括转化生长因子类（transforming growth factor-β，TGF-β）和骨形成蛋白类（bone morphogenetic proteins，BMPs）。诸多体外或在体实验均证明TGF-β类（TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3）能诱导内皮细胞发生EndMT。其主要表现为血管内皮钙黏蛋白（VE-cadherin）和CD31等内皮细胞特异性标志物的表达下调，而α-SMA、FSP-1和Ⅰ型胶原等成纤维细胞特异性标志物表达上调，并伴增殖和迁移能力增强，体外细胞培养可见鹅卵石样内皮细胞转化为长梭形类成纤维细胞。用TGF-β中和抗体拮抗TGF-β的作用，在胚胎心脏发生过程中，内皮细胞不能完成间质转化过程，心脏瓣膜及房室间隔形成缺陷。而在大鼠压力过荷（主动脉缩窄术）模型上，则能防止心肌纤维化，改善舒张功能，这可能与阻断TGF-β介导的EndMT作用有关。

不同亚型的BMP对EndMT的调节能力具有差异。早期研究证实，胚胎心脏发育时房室垫和瓣膜形成过程中，房室沟和心室流出道的心肌细胞特异性表达BMP-4、BMP-2，协同TGF-β3等分子的作用，诱导促进心内膜内皮细胞发生间质转化，完成心脏瓣膜和房室间隔形成，在此过程中还检测到BMP-3、BMP-6、BMP-5、BMP-7等的表达。然而在成年小鼠模型上，BMP-7能够阻断TGF-β1诱导EndMT／EMT的作用，从而减轻心肌纤维化和肾纤维化。

2.炎症因子

炎症过程包括组织损伤、促炎因子的释放、炎症细胞的渗出、新生血管形成和瘢痕形成等环节。近几年很多研究表明，炎症因子与许多器官（肺、肾、皮肤等）的纤维化联系紧密。体外培养人真皮层的微血管内皮细胞，给予炎症因子——肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素（IL）-1β刺激，能表现出成纤维细胞特性，表达出α-SMA、钙调蛋白和Ⅰ型胶原蛋白等，提示真皮微血管内皮细胞在炎症因子诱导下发生了EndMT。该实验证明在炎症因子（IL-1β和TNF-α）短期（＜3天）刺激下，内皮细胞发生的间质转化具有可逆性，即发生间质转化的内皮细胞在去除刺激后可再恢复内皮特性，而长期（＞10天）刺激转化则为永久性的。在体实验及体外培养人结肠微血管内皮细胞实验中，给予炎症因子TGF-β1、IL-1β、TNF-α或单核细胞离心后的上清液刺激，内皮细胞不仅发生形态改变，且其表型及功能均有向成纤维细胞转化的现象。这一实验中，IL-1β可单独诱导肠内皮细胞发生EndMT，转化为成纤维细胞，能表达除α-SMA以外其他成纤维细胞表型，仅当TGF-β1存在时，才有α-SMA表达。但TGF-β1不能单独诱导人肠微血管内皮细胞发生EndMT，其机制与TGF-β1对心内膜细胞的作用存在差异，提示各种炎症因子的作用还存在组织器官特异性。最近研究发现，炎症应激（注射干酪素）可以通过介导EndMT加重高脂饮食载脂蛋白E（apoE）基因敲除小鼠心肌纤维化。IL-6和TNF-α能够诱导胚胎和成体心脏瓣膜细胞发生EndMT，参与主动脉瓣的钙化过程。与心血管疾病密切相关的其他炎症因子是否也能诱导EndMT，参与心肌纤维化及心血管系统的其他病理生理过程，还有待进一步研究。

3.微小RNA

微小RNA（microRNAs，miRNAs）是一类具有高度保守性的短小序列，由22个左右核苷酸构成，参与真核生物基因表达的转录后调节过程，主要功能是抑制目标基因的表达，同时通过降低抑制因子的水平间接上调基因的表达。近几年，很多研究都表明miRNAs在很多疾病（如心力衰竭、心肌肥厚、心肌纤维化、肺纤维化等）中都有不同程度的异常表达。发现miRNA-21的表达上调可以促进心肌纤维化的发生，而miR-133a的作用却与之相反。Ghosh等利用miRNA芯片技术检测了TGF-β诱导的内皮源性（发生了EndMT）成纤维细胞内miRNA水平，发现miRNA-125b、Let-7c、Let-7g、miRNA-21、miRNA-30b和miRNA-195水平在EndMT过程中显著升高，相反另外一些miRNA，如miRNA-122a，miRNA-127，miRNA-196和miRNA-375明显降低。近年，对miRNA调节EndMT机制的研究已成为一大热点，并取得了不少成果，可能为抑制病理状态下EndMT，进而为抗心肌纤维化找到新的有效靶点。

4.生长因子

对心脏瓣膜形成的研究表明，血管内皮生长因子（VEGF）水平与心脏的正常发育密切相关，VEGF表达中等程度升高可能造成明显的后果，可阻碍EndMT，对EMT起负调节作用，影响瓣膜的发育。Yang等也证明VEGF-A能够拮抗甚至逆转TGF-β诱导主动脉瓣内皮细胞的EndMT。已证实血小板源性生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）在纤维化疾病的发病机制中有重要作用，可刺激成纤维细胞增生、分泌其他生长因子和细胞外基质。研究显示活化的成纤维细胞分泌成纤维细胞生长因子-2（fibroblast growth factor，FGF-2），能够促进肺纤维化进程。发生心肌纤维化的PAI-1基因缺陷成年小鼠，心肌组织中可检测到高表达的FGF-2和成纤维细胞生长因子受体-2（FGFR-2），提示FGF在心肌纤维化中可能起作用。阻断PDGF、FGF、VEGF等生长因子的酪氨酸激酶受体，可以延缓肺纤维化。上述研究结果提示，生长因子影响EndMT，对心脏及其他器官的纤维化可能存在重要作用，但有待更多的研究阐明三者之间的联系。

5.蛋白酶

EndMT的启动需要内皮细胞间连接减少，内皮细胞从血管内皮层脱离。细胞的迁移有赖于各种蛋白酶降解细胞外基质。目前已知可能参与EndMT的蛋白酶大多属于基质金属蛋白酶类（matrix metalloproteinases，MMPs）和丝氨酸蛋白酶家族。

MMPs在胚胎发育期和多种病理状态下，对形态发生、细胞迁移和组织重构等方面起着重要的调节作用，有研究表明舒张性心肌病患者的心肌组织中有MMP表达上调。MMP-2参与降解钙黏蛋白，从而切断细胞间的连接，在鸟类胚胎的发育、诱导EMT过程中起着极为重要的作用。Fang Cheng等研究发现卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）依赖膜联1型基质金属蛋白酶（MT1-MMP）参与诱导淋巴管内皮细胞发生EndMT。MMP9基因敲除小鼠心肌梗死后，有左室扩张和心肌纤维化延迟表现，提示这一因子在心脏重构和纤维化中发挥一定作用，可能参与EndMT／EMT，从而影响心肌纤维化过程。

尿激酶型纤溶酶原受体及其激活物（uPAR／uPA）以及纤溶酶原激活物抑制因子（PAI）是丝氨酸蛋白酶家族中研究较多的因子。许多研究证明，PAI-1基因缺陷或uPA表达过高都能引起成年小鼠自发性心肌纤维化及其他器官（如肾、肺等）的纤维化。在PAI-1基因缺陷的成年小鼠模型中检测到高表达的胶原蛋白和MMPs，同时内皮细胞对TGF-β诱导EndMT的敏感性增加。

众多研究均表明，蛋白酶影响EndMT过程，但其对心肌纤维化的作用及具体分子机制还有待进一步研究。

四　EndMT相关的细胞内信号转导途径

揭示EndMT的本质对临床抗纤维化治疗意义重大。EndMT的分子机制目前尚未完全阐明，目前研究较多的信号通路有TGF-β／BMP、Wnt和Notch信号通路等，如图1-9-2所示。

1.TGF-β／BMP信号通路

TGF-β／BMP有2种跨膜受体，即Ⅰ型和Ⅱ型。TGF-β／BMP配体结合各自的Ⅱ型受体后去磷酸化，再与Ⅰ型受体形成异四聚体并磷酸化激活Ⅰ型受体，后者进而磷酸化激活细胞内Smad蛋白质（这是细胞内调节TGF-β／BMP信号通路的主要分子）。TGF-β的受体激活素受体样激酶（ALK4、ALK5、ALK7）、磷酸化Smad2／3，而BMP的受体（ALK1、ALK2、ALK3、ALK6），磷酸化Smad1／5／8。磷酸化的这些Smad分子与它们共同的结合分子Smad4结合，形成异聚体，转移至细胞核内，与转录因子（Snails、slug）作用，调节目标基因的表达，从而使内皮细胞特异性标志物（血管内皮钙黏蛋白、CD31等）表达下降，而成纤维细胞特异性标志物（如α-SMA、FSP-1、波形蛋白等）表达上调。最新研究发现缺血再灌后，过表达Snail的心脏内皮细胞发生EndMT，并分泌结缔组织生长因子（CTGF）激活周边的成纤维细胞，参与纤维化过程，而阻断Snail后心肌纤维化程度明显减轻，心功能得到改善。

2.Wnt信号通路

Wnt信号通路具有高度保守性，见于各种生物体（从昆虫到人类）的生长发育、疾病发生发展过程中。Wnt家族成员是具有各种调节作用的分泌型配体，经典的Wnt信号通路是Wnt蛋白与细胞膜上的Frizzled家族受体结合，激活细胞内主要信号因子β-连环蛋白（β-catenin），这一信号分子向核内聚集，与转录因子LEF／TCF等结合，调节靶基因的表达。研究证明，Wnt信号通路影响心脏瓣膜的形成，参与诱导心内膜细胞发生EndMT过程。实验证明在β-catenin基因敲除的小鼠胚胎模型中，TGF-β诱导内皮细胞生成a-SMA阳性细胞的数量减少，TGF-β2诱导EMT的过程中伴有β-catenin转录的激活，阻断β-catenin的转录可以抑制TGF-β2诱导EMT。Aisagbonhi等研究发现心肌梗死后组织修复过程中，可同时检测到Wnt活化和EndMT现象，发生间质转化的内皮细胞内的Wnt通路被激活。Wnt信号转导途径的下游调节分子β-catenin，LEF1／Tcf可与Smad4形成复合物，共同参与调节EMT过程，提示TGF-β／BMP信号通路与Wnt信号通路之间存在着共同环节或相互作用，共同参与调节EMT／EndMT过程。

3.Notch信号通路

目前已知哺乳动物体内有4种Nocth受体（Nocth1、Notch2、Notch3和Notch4），Notch受体和它的大部分配体（如Delta-like和Jagged）都是单跨膜蛋白，包括胞外与胞内两部分。Notch受体与其配体结合使Notch受体活化水解，细胞内的结构域从原受体解离出来，向细胞核转移，在细胞核内与转录因子结合，作用于相应的靶基因，从而起到调节细胞生长、增殖、分化等过程。研究证明，Notch受体是心血管发生和维持内环境稳态的细胞内信号途径中不可缺少的，它参与调节细胞增生、凋亡及内皮细胞和平滑肌细胞的分化。Jagged1-Notch的相互作用可在心内膜垫形成过程中诱导内皮细胞发生间质转化，并通过激活转录调节因子CSL（DNA结合因子，又称RBP-Jκ／CBF1），调节内皮细胞或平滑肌细胞表达α-SMA。体内和体外实验均证明Notch通路缺陷的胚胎在心瓣膜发育过程中Snail的表达严重减弱，内皮细胞间的连接异常，EndMT过程不能完成，心脏瓣膜发育异常。而Notch1IC（Notch1的胞内部分）过表达可诱导生成Snail，同时抑制血管内皮钙黏蛋白的表达。这些结果证明Notch通路参与EndMT过程，同时也提示Notch信号通路与TGF-β／BMP信号通路之间有相互作用。

还有研究提示除上述3种主要的信号通路外，EndMT还可能涉及其他多种信号通路，如已被证实在EMT／EndMT过程中发挥重要作用的NF-κB、ERK依赖途径等。

4.EndMT与MET

在器官发育过程中，成纤维细胞可以通过间质上皮转化（mesenchymal-to-epithelial transition，MET），参与上皮器官的形成。真皮层微血管内皮细胞体外培养试验发现在IL-1β、TNF-α刺激下，真皮层微血管内皮细胞向间质转化是机体在炎症状态下的病理生理反应，血管内皮细胞发生间质转化后迁移至炎症部位，再转化为典型的内皮细胞，参与血管新生，这一过程既有EndMT，又有MET。亦有研究发现小鼠心肌梗死后，缺血损伤诱导内皮细胞发生EndMT，产生具有双向分化潜能的成纤维细胞，既能再转为典型的内皮细胞参与新生血管的形成，又能转化为成纤维细胞参与纤维化过程。这些研究结果提示EndMT可以通过某种机制与MET之间相互转化，因此开展这方面的研究将对纤维化疾病的治疗带来希望。

总之，EndMT与心肌纤维化密切相关，对EndMT分子机制的研究有助于找到抑制心肌纤维化的有效方法。一方面，与EndMT相关的miRNA的发现和深入研究，将为这一领域的发展提供更多线索。另一方面，在体和离体实验均发现内皮细胞发生EndMT后转化为具有多种分化潜能的成纤维细胞，在不同微环境作用下能够分化成不同类型的组织细胞，为细胞转化、组织工程和再生医学开启了新的视角。但EndMT过程是多种细胞因子、细胞内信号分子相互作用的结果，涉及多种调节机制，各种机制间又存在交叉效应或共同通路，目前的研究还不能完全阐明其机制。现有的很多研究只是单独地分析某一种因子或某一种信号通路的作用，而与EndMT有关的调节分子之间可能形成一个信号网络，相互作用、共同调节EndMT过程，因而对于EndMT的分子机制，还有待进行全面的、整体性的研究。

（舒晓蓉　聂如琼　谢双伦）

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