任务二 植物组织培养常用的仪器设备
植物组织培养是在严格无菌的条件下进行的。要做到无菌的条件，需要一定的设备、器材和用具，同时还需要人工控制温度、光照、湿度等培养条件。
一、实验室基本仪器设备
(一)常规设备
1．空调机
接种室的温度控制，培养室的控温培养，均需要用空调机。培养室温度一般要求常年保持25 ±2℃，空调机可以保证室内温度均匀、恒定。空调机应安置在室内较高的位置，如窗的上框以上的地方等，以便于排热散凉，使室温均匀。若将空调机安装在窗以下位置，室内的上层温度则始终难以降下来。
2．除湿机
湿度也要求恒定，一般保持70%~80%，湿度过高易滋长杂菌，湿度过低培养器皿内的培养基会失水变干，从而影响外植体的正常生长。当湿度过高时，可采用小型室内除湿机除湿；当湿度过低时，可采用喷水来增湿。
3．烘箱
可以用80~100℃的温度，迅速干燥洗净后的玻璃器皿。也可以用160~180℃的温度，进行1~3h的高温干燥灭菌。还可用80℃的温度烘干组织培养植物材料，以测定干物质。
4．冰箱
有普通冰箱、低温冰箱等。用于在常温下易变性或失效的试剂和母液的储藏，细胞组织和试验材料的冷冻保藏，以及某些材料的预处理。
5．天平
包括扭力天平、分析天平、电子天平(图2-6)和药物天平(图2-7)等。大量元素、糖、琼脂等的称量可采用感量为0.1g的药物天平，微量元素、维生素、激素等的称量则应采用感量为0.0001g的分析天平。有条件的，最好配用感量为0.0001g的电子天平。
图2-6 电子天平
图2-7 药物天平
6．显微镜
包括双目实体显微镜(解剖镜)、生物显微镜、倒置显微镜和电子显微镜。显微镜上要求能安装或带有照相装置，以对所需材料进行摄影记录。
(1)双目实体显微镜 双目实体显微镜下可进行培养材料(如茎尖分生组织、胚等)的分离，解剖和观察植物的器官、组织，也可以从培养器皿的外部观察细胞和组织的生长情况。
(2)生物显微镜 生物显微镜可用于观察花粉发育时期以及培养过程中细胞核的变化。
(3)倒置显微镜 倒置显微镜物镜在镜台下面，可以从培养皿的底部观察培养物。
(4)电子显微镜 简称电镜或电显，是使用电子束来展示物件的内部或表面的显微镜。
7．水浴锅
水浴锅可用于溶解难溶药品和熔化琼脂条。
8．蒸馏水发生器
制备培养基所用的重蒸馏水，是将蒸馏水再蒸馏一次，使水中不含或少含某些离子，以便完全人为控制培养基成分。因此，实验室设置一套蒸馏水发生器是必要的。蒸馏器一般有两种，一种是用蒸馏水重新蒸馏，另一种是用自来水连续蒸馏两次，以获得重蒸馏水。此外，还可用纯水发生器将自来水制成纯净的实验室用水，生产速率可达到4L/h、15L/h或40L/h(因型号而异)。这种水与“试剂级”水比较，其杂质的含量仍然太高，但却得到了质量一致的较好的实验室用水。
9．酸度计
用于校正培养基和酶制剂的pH值。半导体小型酸度测定仪，既可在配制培养基时使用，又可在培养过程中测定pH值的变化。
10．离心机
用于分离培养基中的细胞以及解离细胞壁后的原生质体。一般转速为3000~4000r/min即可。
(二)灭菌设备
1．高压灭菌锅
高压灭菌锅(图2-8)是一种密闭良好又可承受高压的金属锅，其上有显示灭菌锅内压力和温度的表头。高压灭菌锅上还有排气孔和安全阀。高压灭菌锅是对培养基和操作工具、器皿器具、工作服装等进行灭菌的设备。在密闭的高压蒸汽灭菌锅内，当压力表指示蒸汽压增加到0.105MPa时，温度则相当于121℃，在这种温度下20min即可完全杀死细菌的繁殖体及芽孢。
图2-8 高压灭菌锅
2．干热消毒柜
用于干燥洗净后的玻璃器皿，也可用于干热灭菌和测定干物重。一般选用200℃左右的普通或远红外消毒柜。用于干燥需保持80~100℃；干热灭菌时需160℃保持1~2h；若测定干物重，则温度应控制在80℃烘干至完全干燥为止。
3．过滤灭菌器
一些生长调节物质(如IAA、GA3)、有机附加物(如香蕉汁、椰子汁)等在高温条件下易被分解破坏而丧失活性，可用孔径为0.22μm微孔滤膜来进行除菌。过滤灭菌时需要一套减压过滤装置或注射器过滤组件。
4．接种器械灭菌器
接种器械灭菌器为电加热高温干式消毒灭菌，由数显控制面板、石英珠、发热层(板)组成，将电能转化为热能加热石英珠，把接种的刀、剪、钳、针插入石英珠内15~20s，便可完成对接种工具的消毒灭菌(图2-9)。
图2-9 接种器械灭菌器
5．臭氧发生器
臭氧发生器主要用于空气的消毒杀菌。臭氧在常温常压下能自行分解成氧气和单个氧原子，而氧原子对微生物有极强的氧化作用，臭氧氧化分解了微生物内部氧化葡萄糖所必需的酶，从而破坏其细胞膜，将它杀死，多余的氧原子则会自行重新结合成为普通氧气分子。臭氧消毒杀菌效果好，不存在任何有毒残留物，对多种细菌、病毒、芽孢均有很强的杀灭力。
6．紫外线灯
紫外线灯产生的紫外线具有杀菌作用。紫外线灯主要用于对接种室、缓冲室、培养室等处空气和环境的消毒。
(三)无菌操作设备
1．超净工作台
超净工作台(图2-10)原系工业上用于半导体元件与精密仪器的装配，如今已成为组织培养上的一种最通用的无菌操作装置。它占地小，效果好，操作方便。超净工作台的空气通过细菌过滤装置，以固定不变的速率从工作台面上流出，在操作人员与操作台之间形成风幕，净化进入台面的空气，保证了台面的无菌状况。
图2-10 超净工作台
2．无菌箱
条件不足时可用最简单的无菌箱来代替超净工作台，前面装玻璃，操作中便于观察，左右两侧有两个孔，孔内侧有布质袖罩，无菌箱上方安装紫外线灯和日光灯，箱内放置工作所需的物品。无菌箱比较简易，容易办到，但操作不方便，比较费工夫。
(四)培养设备
1．摇床(振荡培养机)
在液体培养中，为了改善浸于液体培养基中的培养材料的通气状况，可用摇床来振动培养容器。振动速率每分钟60~120次为低速，每分钟120~250次为高速，植物组织培养可用每分钟100次左右。摇床冲程应在3cm左右。冲程过大或转速过高，会将细胞震破。
2．转床(旋转培养机)
转床同样用于液体培养。由于旋转培养使植物材料交替地处于培养液和空气中，所以氧气的供应和植物材料对营养的利用更好。通常植物组织培养用1r/min的慢速转床，悬浮培养需用80~100r/min的快速转床。
3．恒温箱
恒温箱又称培养箱，可用于植物原生质体和酶制剂的保温，也用于组织培养材料的保存和暗培养。恒温箱内装上日光灯，可进行温度和光照实验。
4．光照培养箱和人工气候箱
光照培养箱和人工气候箱可自动控制温度、湿度和光照，主要用于试管苗培养和移栽。
5．培养架
培养架是进行固体培养时，摆放培养材料的设备。它有多层，每层均有照明设备。在培养架的顶部多安装反光膜或反光镜，以增强光照，每层架的隔板可采用玻璃板、金属网或木板。
二、实验室常用器皿、器械
(一)常用器皿
1．培养器皿
配制培养基和进行培养都需大量的器皿。器皿按材料可分为玻璃器皿和塑料器皿两种。玻璃器皿需用碱性溶解度小的优质硬质玻璃制成，以保证长期储藏药品与培养的效果；塑料培养器皿需用耐高温高压的材料制成。玻璃培养器皿的优点是透光度好、容易清洗，缺点是容易破碎；塑料培养器皿的优点是不容易破碎、成本较低，但缺点是透光度较玻璃培养器皿差、遇火焰易熔化。目前制成的塑料器皿可以进行高温高压灭菌，并对培养物无害。故现在在很多实验室内，玻璃培养器皿和制备培养基所需的其他玻璃器皿都已被塑料器皿所取代。特别是那些用于原生质体、细胞、组织和器官培养的塑料器皿，在出厂时即是无菌的。这种塑料器皿在国外已得到普遍应用，在国内也已生产并被使用。
按其形状可分为试管、三角瓶、圆形培养瓶和培养皿等。也有进行转动培养并使液体流动时用的L形管和T形管；还有在瓶外用显微镜观察细胞的分裂和生长情况，并便于摄影记录的长方形扁瓶、圆形扁瓶、平型有角试管和无角试管等。这些不同类型的培养器皿都可用来培养植物材料，但具体采用哪一种，有时取决于实验性质，有时取决于器皿使用是否方便，有时还取决于研究工作者的爱好与资金实力等。在一般的组织和细胞培养工作中，玻璃试管和三角瓶是广泛应用的器皿。当然，在条件不许可的情况下，各种大小的广口玻璃瓶，有时甚至牛奶瓶和罐头瓶也都可以利用，特别在快速繁殖时更是如此。不过在组织培养中只应用硼硅酸盐玻璃器皿，钠玻璃对某些组织可能是有毒的，重复使用时毒害会更明显。
(1)试管 特别适合用少量培养基及试验各种不同配方时选用，在茎尖培养及花药和单子叶植物分化长苗培养时更显方便，有圆底的和平底的两种。
(2)三角瓶 是植物组织培养中最常用的培养器皿，适合于各种培养，固体或液体、大规模或小规模都行。常用的是50mL、100mL、150mL和300mL的三角瓶。其优点是：采光好、瓶口较小不易失水和不易被污染。
(3)L形管和T形管 为专用的旋转式液体培养试管。
(4)培养皿 适用于单细胞的固体平板培养、胚和花药培养以及无菌发芽。常用的有直径为40mm、60mm、90mm和120mm的培养皿(图2-11)。
图2-11 培养皿
(5)果酱瓶 常用于试管苗的大量繁殖，一般用200~500mL的规格(图2-12)。
图2-12 果酱瓶
2．实验器皿
主要是量筒(25mL、50mL、100mL、500mL和1000mL)、量杯、烧杯(100mL、250mL、500mL和1000mL)(图2-13)、吸管、滴管、容量瓶(100mL、250mL、500mL和1000mL)、称量瓶、试剂瓶、玻璃缸、玻璃瓶、塑料瓶、酒精灯、储藏母液的棕色玻璃瓶(图2-14)等。
图2-13 烧杯
图2-14 棕色玻璃瓶
(二)分注器
分注器可以把配制好的培养基按一定量注入培养器皿中。一般由4~6cm的大型滴管、漏斗、橡皮管及铁夹组成。还有量筒式的分注器，上有刻度，便于控制。微量分注还可采用注射器。
(三)离心管
离心管用于离心，将培养的细胞或制备的原生质体从培养基中分离出来，并进行收集。
(四)刻度移液管
在配制培养基时，生长调节物质和微量元素等溶液，用量很少，只有用相应刻度的移液管才能准确量取。同时，不同种类的生长调节物质不能混淆，这就要求专管专用。常用的刻度移液管容量有0.1mL、0.2mL、0.5mL、2mL、5mL、10mL等(图2-15)。
图2-15 刻度移液管
(五)常用的器械(图2-16)
图2-16 常用的器械
(1)镊子 尖头镊子，适用于取植物组织和分离茎尖、叶片表皮等。长20~25cm的枪形镊子，可用于接种和转移植物材料。
(2)剪刀 常用的有解剖剪和弯头剪，一般在转移植株时用。
(3)解剖刀 常用的解剖刀，有长柄和短柄两种。刀片也有双面及单面之分，可以经常更换。对大型材料如块茎、块根等就需用大型解剖刀。
(4)接种工具 包括接种针、接种钩及接种铲，用来接种花药或转移植物组织。
(5)钻孔器 取肉质茎、块茎、肉质根内部的组织时使用。钻孔器一般做成T形，口径有各种规格。
(6)其他 燃烧工具用的酒精灯、用于熔解培养基的带有磁搅拌器的电炉、用于加速熔解琼脂培养基的微波烘箱、用于贮备去离子水和重蒸馏水的大型塑料桶、试管架以及转移培养瓶、试管架的搪瓷盘或塑料框等。
实验2-1 植物组织培养实验室设计及常用设备仪器的使用
一、实验目的
1．能够根据要求进行植物组织培养实验室的设计，并绘制出实验室草图。
2．认识组织培养必需的仪器、器皿，掌握几种主要设备的使用方法。
二、器材与试剂
1．植物组织培养实验室，测量尺、记录本等。
2．组织培养常用的仪器设备和器具，如电子天平(精密度1/100、1/10000)，高压灭菌锅，电冰箱，超净工作台，光照培养箱，精密pH(5.4~7.0)试纸，酒精灯，玻璃器皿(试剂瓶、烧杯、量筒、容量瓶、移液管、培养瓶等)，接种器械(镊子、解剖刀、剪刀等)，灭菌器等。
三、方法及步骤
1．教师讲解实验室的规章制度及有关注意事项，实验室各组成部分的功能与设计要求。
2．学生分组，在老师的带领下参观实验室，讲解各个分区的功能。同时，教师介绍组织培养实验室常用设备及其使用方法。
3．教师与学生共同讨论实验室的规划设计问题。
4．学生根据要求自己动手设计实验室，绘制组织培养实验室草图。
四、注意事项
实验前指导教师和实验员必须做好充分的准备，明确组织培养实验室的规章制度及其特殊性，强调参观的纪律要求。
五、实验报告
1．绘制一幅植物组织培养实验室的设计图。
2．写出植物组织培养实验室各个组成部分的功能及仪器设备。
实验2-2 器皿及用具的洗涤与环境消毒
一、实验目的
1．通过实验使学生树立无菌观念，养成良好的无菌操作习惯。
2．掌握实验室常用器皿及用具的洗涤方法。
3．掌握实验室环境的消毒方法。
二、器材与试剂
(1)材料与试剂 去污粉、肥皂、洗衣粉、重铬酸钾、工业浓硫酸、2%盐酸溶液、蒸馏水。
(2)仪器与用具 试管、三角瓶、培养皿、培养瓶、试剂瓶等容器；量筒、烧杯、移液管等量具；镊子、剪刀、解剖刀、接种针等器械。
三、方法及步骤
1．器皿及用具的清洗
(1)洗涤液配制 常用的洗涤液有70%酒精、0.1%~4%高锰酸钾溶液、1%稀盐酸溶液、4%重铬酸钾-硫酸溶液(铬酸洗液)、10%~20%洗衣粉溶液及洗涤剂溶液等。
4%重铬酸钾-硫酸溶液(铬酸洗液)的配制方法：称取25g重铬酸钾，加水500mL，加温溶化，冷却后再缓缓加入90mL工业浓硫酸即配成较稀的洗液。铬酸洗液可加热使用，增强去污作用，一般可加热到45~50℃。铬酸洗液可以重复使用，直到溶液变成青褐色为止。
(2)器皿及用具清洗 新购置的玻璃器皿因有游离碱性物质，可采用酸洗法洗涤。先用1%稀盐酸溶液浸泡4h以上，然后用自来水冲洗；再加洗衣粉溶液及洗涤剂溶液刷洗，用自来水冲洗；最后用蒸馏水冲洗后，沥干备用。
日常使用过的容器应先除去瓶内残渣，用自来水冲洗，再用10%~20%洗衣粉溶液及洗涤剂溶液浸泡、刷洗，洗衣粉及洗涤剂溶液加热后去污力更强，然后用自来水冲洗，最后用蒸馏水冲洗后，沥干备用。
吸管、滴管等较难刷洗的玻璃器皿及用具可先放入铬酸洗液中浸泡数小时，取出后用自来水冲洗30min，再用蒸馏水冲洗，稍沥水后置于干燥箱内烘干备用。吸管、滴管等首次使用前也必须用洗涤液泡洗。
金属用具一般不宜用各种洗涤液洗涤，可用酒精擦洗，并保持干燥，新购置的金属器械若表面有润滑油或防锈油，可用棉球蘸取四氯化碳(CCl4)擦去油脂，再用湿布擦净，干燥备用。塑料用品一般用合成洗涤剂洗涤，因其附着力较强，必须反复冲洗多次，最后用蒸馏水冲洗，沥干备用。
2．接种室、培养室环境消毒
(1)药剂熏蒸 接种室、培养室应定期采用甲醛和高锰酸钾熏蒸消毒，一般每年2~3次。每1m3空间用5~8mL甲醛、5g高锰酸钾。先将称好的高锰酸钾倒入一个较大的容器内(玻璃罐头瓶或陶瓷罐)，放入房屋中间的地面上，再将量取的40%甲醛溶液缓慢倒入，当烟雾产生后操作人员应迅速离开，并密封门窗。2~3d后再开启门窗，排出甲醛废气。另外，也可选用冰醋酸加热熏蒸消毒。
(2)药液喷雾 经常用0.25%新洁尔灭溶液(取5%新洁尔灭原液50mL，加水950mL配成)或漂白粉液(取漂白粉10g，加水140mL配成，现配现用，配好后静置1~2h，取上清液)或70%酒精喷雾，对接种室、培养室空间及墙壁、超净工作台消毒。喷雾要均匀，不留死角，并注意安全。
(3)紫外线照射 每次接种前打开缓冲室、接种室和超净工作台内的紫外线灯，照射20~30min。
(4)药液擦拭 用棉布或毛巾蘸取70%酒精或0.1%高锰酸钾溶液擦拭培养架等，做好卫生清理工作。
四、注意事项
实验前指导教师和实验员必须做好充分的准备，教师应特别强调在操作过程中注意安全。教师讲解示范后，学生分组操作。学生应轮流负责实验室器皿洗涤、环境清洁、消毒剂空气污染状况检测。
五、实验报告
写出器皿及用具的洗涤步骤。
知识小结
※植物组织培养实验室设计
1．基本要求：远离污染源、交通便利、合理规划面积和组成，按照操作流程来设计。
2．实验室构成：准备室、缓冲室、无菌操作室、培养室、移栽驯化室等。
3．实验室类别：普通实验室、家庭组培室、组培工厂。
※植物组织培养实验室主要设备
1．灭菌设备：高压灭菌锅、干热消毒柜、过滤无菌器、接种器械灭菌器、臭氧发生器、紫外线灯。
2．无菌操作设备：超净工作台、无菌箱。
3．培养设备：摇床、转床、恒温箱、光照培养箱、人工气候箱、培养架。
4．其他设备：解剖镜、显微镜、培养器皿、称量仪器、分装设备、离心机、酸度计等。
复习测试题
一、名词解释(每题4分，共32分)
1．无菌操作室
2．高压灭菌锅
3．过滤灭菌器
4．超净工作台
5．摇床
6．培养架
7．分注器
8．接种工具
二、填空题(每空1分，共22分)
1．植物组织培养是一项技术性较强的工作。为确保培养成功，植物组织培养的全过程要求严格的____ 和____，在专门的植物组织培养 ____内进行。
2．一个标准的植物组织培养实验室能够满足整个组织培养工艺流程，通常需要具备以下四个单元：____ 、缓冲室、____ 和____。
3．植物组织培养实验室的大小、繁简可以根据组培目的而定，但必须能够完成____、____ 和____ 三个基本环节。
4．常见的培养器皿有试管、____ 、____ 和 ____。
5．植物组织培养的无菌操作需要 ____、____ 、____、____等金属用具。
6．清洗玻璃器皿用的洗涤剂主要有肥皂、____、____和 ____。
7．新购置的玻璃器皿的清洗步骤是，先用____ 浸泡，然后用 ____洗净，清水冲洗，最后 ____冲淋1遍，干后备用。
三、是非题(每题1分，共5分)
( )1．无菌操作室适当位置应吊装1~2盏紫外线灯，用以经常地照射灭菌。
( )2．瓶口封塞可用多种方法，但要求绝对密闭，以防止培养基干燥和杂菌污染。
( )3．分注器的作用是把配制好的培养基按一定量注入培养器皿中。
( )4．干燥箱用于干燥需保持80~100℃；进行干热灭菌需保持120℃，达1~3h。
( )5．培养室湿度要求恒定，一般保持相对湿度70%~80%。
四、选择题(每题1分，共5分)
1. ____用于配制培养基时添加各种母液及吸取定量植物生长调节物质溶液。
A．移液管
B．分注器
C．过滤灭菌器
D．酸度计
2.____ 用于切取很小的外植体(如茎尖分生组织、胚胎等)和解剖、观察植物的器官、组织等。
A．倒置显微镜
B．电子显微镜
C．双目实体显微镜
D．普通生物显微镜
3．离心机用于分离培养基中的细胞以及解离细胞壁内的原生质体，一般选择低速离心机，每分钟____ 转左右即可。
A．1000
B．2000
C．3000
D．4000
4．植物组织培养的振动速率可用每分钟____ 次左右，摇床冲程在____ 左右。
A．100,3cm
B．100,2cm
C．200,3cm
D．200,3cm
5．培养室温度一般要求常年保持____ ℃左右。
A．20
B．22
C．25
D．28
五、问答题(每题6分，共36分)
1．一个植物组织培养实验室的设计需要考虑哪些因素？
2．植物组织培养实验室的各分室分别起哪些作用？
3．无菌操作室为什么一般配有缓冲室？缓冲室有何功能？
4．已被真菌等杂菌污染的玻璃器皿应该如何清洗？
5．实验室环境消毒有哪些方法？
6．请根据所在教室实际情况，将其设计改造成一个植物组织培养实验室。