第五节 常用菌种选育原理和方法

一、人工选种流程

（一）人工选种的基本流程

（二）人工选种方法

1.自然选种

该法是通过广泛异地引种、野生采集、孢子分离等途径获得菌种，将其进行驯化移栽，使其逐渐适应当地环境条件，并从中选优汰劣，选出性状优异的菌株。在菌种生产以及试验性栽培中，反复进行比较和选择，最终确定优良的食用菌品种。

2.杂交育种

该法是通过将不同遗传性状的亲本之间进行交配，使遗传物质重新组合配对，通过双亲性状的优势互补或借助于以一个亲本的优点去克服另一亲本的缺点，产生具有其双亲优点的育种方法。杂交育种一般有单孢杂交、多孢杂交、单双核杂交、原生质体融合等方法，一般科研、育种上多采用单孢杂交或原生质体融合，通过这些办法处理的菌种常常可表现出较强的“杂交优势”。

3.诱变育种

该法是利用物理的或化学的方法处理细胞群体，促使菌种的细胞遗传物质发生性状的改变，然后从变异的菌种中选出具有优良性状的菌种的方法。科研上常用的主要有辐射诱变育种，如紫外线照射、X射线等高能量射线，以及用一些化学药剂进行诱变育种。

4.基因工程育种

该法是在基因分子水平上的遗传工程，又称基因操作、基因克隆、脱氧核糖核酸（DNA）重组技术等，基本原理就是把我们需要的目标基因通过载体DNA与原品种的DNA结合，然后人工导入一个受体细胞内，以让外来的遗传物质在其中“着生”，进行正常的复制，从而获得预先设计的新菌种。

二、菌种分离技术

食用菌的菌种分离可以分为组织分离、孢子分离和基内菌丝分离三种。

（一）组织分离法

食用菌组织分离法是利用子实体机体内部分组织在无菌条件下培养、提纯来分离获得纯菌丝的一种方法。该法操作简便、材料易得、变异率小，同时能较好保持食用菌品种的种性。下面介绍几种典型的食用菌组织分离法。

1.大型伞菌组织分离

一些大型的食用菌品种，如双孢菇、杏鲍菇、草菇、大球盖菇等，其菇盖肥厚，菌柄粗壮，可以方便的从其子实体上获得组织块。这种类型的子实体组织分离方法流程如下。

2.特殊菌类组织分离

（二）孢子分离法

食用菌孢子分离法是在无菌条件下，利用成熟子实体弹射出来的有性孢子在适宜的培养基上萌发成菌丝，而获得纯种的一种方法。下面介绍几种典型的食用菌组织分离法。

1.多孢分离法

该法是利用子实体弹射许多孢子在同一培养基上，让其萌发、自由交配，从而获得纯母种的方法。该法简便易行，在食用菌选种中应用普遍。

（1）整菇孢子弹射法　该法适用于伞菌类的孢子采集。在无菌室（箱）中，将经消毒处理的整只种菇插入无菌平皿孢子收集器里，之后使用透明玻璃钟罩将其罩住，于见光、适温下使菇自然弹射孢子。24h后，将玻璃钟罩打开，从培养皿内获取孢子。见图1-10。

（2）试管插割法　在无菌箱内，迅速用无菌试管插割种菇有菌褶一侧，直至取下组织块。用无菌接种镐将组织块菌褶朝下推至距斜面培养基1cm处，塞好棉塞即可。于25～28℃条件下见光竖立培养至12h左右，在无菌操作条件下用尖头镊子取出组织块。继续于25～28℃的条件下暗光培养，2～3天后，会看到孢子萌发成星芒状的孢子菌落。见图1-11。

（3）三角瓶钩悬法　在无菌箱内，将耳片或菌盖用无菌水洗涤，无菌纱布吸干，取一个事先灭菌好的带培养基的三角瓶，棉塞内裹金属钩，钩取种菇块前，将金属钩经火焰灭菌后一端钩住耳片或菌盖（菌褶朝下），之后迅速塞好棉塞，于室温下见光培养1～2天，至培养基表面获得孢子粉时即可。见图1-12。

（4）贴褶法　在无菌箱内，用无菌镊子夹取一片即将弹射孢子的菌褶，使其一端蘸取无菌水，贴至试管斜面培养基上方，塞好棉塞即可。于25～28℃条件下见光培养12h左右，在无菌操作条件下用尖头镊子取出菌褶。继续于25℃的条件下暗光培养，2～3天后，会看到孢子萌发成星芒状的孢子菌落。见图1-13、

2.单孢分离法

单孢分离是从收集到的多孢子中将单个孢子分离出来，分别培养，作为育种的材料。该法是利用子实体弹射许多孢子制成孢子悬浮液，利用稀释法、平板划线分离法、器械分离法和毛细管法获取单孢子的方法。该法在食用菌育种中应用普遍。单孢分离的方法常用的主要有涂抹法和梯度稀释点样法两种。

（1）涂抹法　通过整菇孢子弹射法、试管插割法、三角瓶钩悬法和贴褶法等方法获得大量多孢子。之后配制无菌孢子液，用已沾湿无菌水的接种环，从前面获得的孢子粉上沾取孢子，在无菌条件下，插入盛有无菌水的三角瓶内振荡稀释成适宜浓度的孢子悬浊液。在无菌条件下，用无菌的接种环蘸取孢子悬浊液，在平板内培养基上轻划数条“Z”形线，使蘸到接种环上的孢子悬浊液沿“Z”形线均匀分散开。之后将平板培养基置于25℃下遮光培养。待孢子萌发后，在无菌条件下，用无菌的接种针挑取“Z”形线上的单孢群落，并通过镜检来确定是否为单孢菌丝。见图1-14。

（2）梯度稀释点样法　首先配制无菌孢子液，通过整菇孢子弹射法、试管插割法、三角瓶钩悬法和贴褶法等方法获得大量多孢子。用已沾湿无菌水的接种环，从前面获得的孢子粉上沾取孢子，在无菌条件下，插入盛有无菌水的三角瓶内振荡稀释成适宜浓度的孢子悬浊液。接着配制梯度孢子液，取5支试管，分别装9mL蒸馏水，经高压灭菌制成无菌水。用无菌注射器吸取1mL孢子悬浮液于第1支试管中，摇振使其分散；再从第1支试管中吸取1mL注入第2支试管……如此直至稀释到第5支试管。这样按无菌操作规程将孢子悬浊液配制成梯度孢子悬浮液，每个梯度间的孢子液浓度稀释10倍。之后在无菌条件下，用无菌的接种环蘸取每个梯度孢子液分别在平板内划线操作。之后将各平板培养基置于25℃下遮光培养。待孢子萌发后，在无菌条件下，用无菌的接种针挑取“Z”形线上的单孢群落，并通过镜检来确定是否为单孢菌丝。见图1-15。

（三）基内菌丝分离法

对于一些不容易获得子实体的菌类，或是错过了出菇季节，我们则应考虑通过基内菌丝分离来获得较纯菌丝。基内菌丝分离我们可以从菇木内分离，也可以从土壤内进行分离。这里仅介绍菇木内菌丝分离。