第2部分　熊蜂生理方面的研究进展

小峰熊蜂可溶型海藻糖酶基因的克隆及表达分析

秦加敏1，2，罗术东1，廖秀丽1，黄家兴1，和绍禹2，吴杰11

（1　中国农业科学院蜜蜂研究所/农业部授粉昆虫生物学重点实验室，北京　100093；

2　云南农业大学东方蜜蜂研究所，昆明　650201）

摘要：【目的】克隆小峰熊蜂（Bombus hypocrita）可溶型海藻糖酶基因（soluble trehalase， Tre-1）全长cDNA序列，预测该基因及其编码蛋白的理化性质，明确该基因在小峰熊蜂不同组织及不同发育时期的表达特性，为研究该基因在小峰熊蜂生长发育中的生物学功能奠定基础。【方法】根据地熊蜂（B. terrestris）和B. impatiens可溶型海藻糖酶基因Tre-1编码蛋白的保守区序列，利用Primer Premier 5.0设计简并引物扩增得到小峰熊蜂保守区片段；随后根据该片段设计基因特异性引物，用RACE方法获得5’端和3’端片段。在此基础上，根据RACE扩增所得片段和保守序列，预测开放阅读框（ORF）序列，分别在起始密码子近5'端和终止密码子的近3’端设计ORF区特异性引物扩增得到ORF，最后采用BioEdit软件比对、拼接获得小峰熊蜂Tre-1 cDNA全长序列。运用ExPASy、SignalP 4.1、NetOGlyc 1.0 sever、ClustalW和MEGA 5.0等软件对该基因进行生物信息学分析，并利用实时荧光定量PCR技术，采用2-ΔΔCt方法检测不同组织及不同发育时期可溶型海藻糖酶基因的相对表达量。【结果】克隆所得基因cDNA全长为3129bp，命名为BhTre-1（GenBank登录号：KJ025078），其中包含5’端441bp非编码区和3’端945bp非编码区，ORF为1743bp，共编码580个氨基酸。其编码的蛋白预测分子质量为67.16kD，等电点为5.95；有1个信号肽结构（1-21位），1个甘氨酸富集区（GGGGEY），2个特色“标签序列”（PGGRFKEFYYWDSY和QWDFPNAWPP），6个Asn-Xaa-Ser/Thr（N-X-S/T）序列，无跨膜区。序列分析发现BhTre-1氨基酸序列与地熊蜂BtTre-1和B.impatiens BiTre-1的一致性很高，分别为99％和98％，与西方蜜蜂（Apis mellifera）和云南小蜜蜂（A.florea）的Tre-1一致性也达到78％；系统发育分析也表明BhTre-1与BtTre-1、BiTre-1的亲缘关系最近，与AmTre-1、AfTre-1之间的亲缘关系次之。基因定量分析结果显示BhTre-1在成虫被检测的各组织中均有表达，在中肠的表达量最高，其次是马氏管，其他各组织表达量较低。成年工蜂的BhTre-1表达量高于幼虫和蛹，工蜂出房后随着龄期的增加表达量呈现先升高后降低的规律，在第15天表达量最高。【结论】克隆得到了BhTre-1全长cDNA序列，其分子生物学特性与其他昆虫Tre-1相似，该基因在小峰熊蜂中肠表达量最高，此外，幼虫和蛹的表达量低于成年工蜂，工蜂出房后表达量呈现先升高后降低的趋势，为进一步研究该基因在小峰熊蜂体内的生物学功能奠定了基础。

收稿日期：2014-06-26；接受日期：2014-08-18

基金项目：国家自然科学基金（31201858）、国家蜂产业技术体系（CARS-45）

联系方式：秦加敏，Tel：010-62596843；E-mail：qjm20122@163.com。通信作者罗术东，Tel：010-62591749；E-mail：luoshudong@caas.cn；通信作者吴杰，Tel：010-62591543；E-mail：apis@vip.sina.com

关键词：小峰熊蜂；可溶型海藻糖酶基因；克隆；序列分析；基因表达

Molecular Cloning and Expression Analysis of a Soluble Trehalase Gene Tre-1 in Bombus hypocrita

QIN Jia-min1，2，LUO Shu-dong1，LIAO Xiu-li1，HUANG Jia-xing1，HE Shao-yu2，WU Jie1

（1. Institute of Apiculture，Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory for Biology of Insect-Pollinator，Ministry of Agriculture，Beijing 100093；2. Institute of Eastern Bee，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201）

Abstract　【Objective】The objective of this study is to clone full-length cDNA sequence of the soluble trehalase gene（Tre-1）in Bombus hypocrita，predict the physicochemical properties，clarify its expression in different tissues and developmental stages，and to understand the function of this gene in the development of B. hypocrita. 【Method】 Degenerate primers were designed by using Primer Premier 5.0 software according to the conservative sequences of Tre-1 in B. terrestris and B. impatiens to get the corresponding conservative fragment in B. hypocrita. Gene-specific primers were designed according to the conserved fragment. The rapid-amplification of cDNA ends（RACE）method was used to clone B. hypocrita 5′ and 3′ sequences，then the open reading frame（ORF）was amplified by the specific primers based on the initiation codon and termination codon near 5′ and 3′，respectively. Different fragments were spliced by BioEdit to obtain the full-length cDNA. The full-length cDNA was analyzed by a variety of bioinformatics softwares such as ExPASy，SignalP 4.1，NetOGlyc 1.0 sever，ClustalW and MEGA 5.0. Finally，the relative expression of Tre-1 in different tissues and developmental stages in B. hypocrita were analyzed by real-time PCR and 2-ΔΔCtmethod. 【Result】 The full-length cDNA of B. hypocrita Tre-1 is 3 129bp，and designated as BhTre-1（GenBank number：KJ025078）. The bioinformatics analysis suggested that BhTre-1 has an ORF of 1 743bp，a 5′（untranslated region）UTR of 441bp and a 3′UTR of 945bp. The ORF of BhTre-1 encodes a polypeptide of 580 amino acids with a predicted molecular weight of 67.16kD，and an isoeletric point value of 5.95. The deduced amino acid sequence has six predicted sequences of Asn-Xaa-Ser/Thr，a signature peptide，a highly conserved glycine-rich region（GGGGEY），and two conserved signature motifs（PGGRFKEFYYWDSY and QWDFPN AWPP），but no transmembrane domain. Homology comparison found that BhTre-1 has the greatest similarity to B. terrestris BtTre-1（99％）and B. impatiens BiTre-1（98％），it also has greater similarity to Tre-1 of Apis mellifera and A. florea which have 78％ sequence homology. The phylogenetic tree analysis showed that BhTre-1 was first clustered with BtTre-1，BiTre-1，AmTre-1 and AfTre-1. The results agreed with the sequence homology analysis. Tissue-specific expression results indicated that BhTre-1 was expressed in all the major tissues，it had the highest expression in midgut，then Malpighian tubules，and lower expression in other tissues. The expression of BhTre-1 in adult worker was higher than at larva and pupa stages，and it increased from the 1st day after emergence，and had the maximum expression in the 15-day-old adults，then，it decreased with the age.【Conclusion】The cDNA sequence of BhTre-1 was successfully cloned from B. hypocrita，and the properties were similar with Tre-1 of other insects. BhTre-1 has the highest expression in midgut. In addition，the expression of BhTre-1 of adult worker was higher than at larva and pupa stages，and the expression of BhTre-1 increased first and then decreased. This study indicated that the expression patterns in different tissues and developmental stages of B. hypocrita，which will lay a foundation for biological functional research of BhTre-1.

Key words　Bombus hypocrita；soluble trehalase gene；clone；sequence analysis；gene expression

0　引言

【研究意义】熊蜂隶属于蜜蜂总科（Apoidea）蜜蜂科（Apidae）熊蜂属（Bombus），是一些高寒地区濒危植物的主要传粉者，对于维持生态系统的多样性具有重要意义[1]，同时，其不发达的信息交流系统和趋光性弱等特点使其比蜜蜂更适合为设施农业授粉[2-3]。海藻糖被誉为昆虫的“血糖”，几乎存在于昆虫所有的组织和器官中，是昆虫血淋巴中最主要的糖类[4-5]。海藻糖酶是昆虫体内唯一能够水解海藻糖的酶，能特异性地将一分子海藻糖分解成两分子葡萄糖，为昆虫各组织的活动提供能量支持。因此，加强对授粉昆虫海藻糖酶的研究，明确其在昆虫体内的重要作用及其生物学特性对于保护和利用授粉昆虫具有重要的意义。【前人研究进展】海藻糖在昆虫的生长发育、能量代谢、取食行为[6-7]、蜕皮过程几丁质合成[8]、抗逆[9]和滞育[10]等重要生理活动具有重要的作用，而海藻糖酶也是昆虫各种生理活动中物质和能量代谢的一个关键性酶[11]，该酶由海藻糖酶基因编码，其氨基酸序列具有2个特色“标签序列”（PGGRFEFYYWDSY和QWDYPNAWPP）及1个甘氨酸富集区（GGGGEY）[12-14]。在昆虫体内，海藻糖酶基因以2种不同的形式存在：一种是可溶型海藻糖酶基因（Tre-1），最先在黄粉虫（Tenebrio molitor）中被克隆出来，游离于细胞内，主要存在于消化系统和循环系统中[15]，在能量代谢[16]、昆虫长距离飞行、生殖[17]和几丁质合成[18]中均具有重要的作用。另一种为膜结合型海藻糖酶基因（Tre-2），于2005年在家蚕（Bombyx mori）中获得，主要存在于肌肉中，与线粒体膜结合[19]，其最鲜明的特征是存在跨膜结构或潜在跨膜结构，在昆虫的蜕皮变态[20-21]、生长发育[22]、肌肉运动及中肠几丁质的合成[18]中发挥重要作用。此外，海藻糖酶基因是一种非组织特异性表达基因，可以在多种组织中表达，它能诱导蚕卵滞育，提高抗寒性[23]。【本研究切入点】近年来对昆虫海藻糖酶基因的研究主要集中在绿盲蝽（Apolygus lucorum）[24-25]、大豆蚜（Aphis glycines）[26]、甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）[18]、玉米螟（Ostrinia furnacalis）、棉铃虫（Helicoverpa armigera）[27]和烟粉虱（Bemisia tabaci）[28]等昆虫中，而对传粉类昆虫海藻糖酶基因的研究并不多，现有的研究也仅局限于蜜蜂属[29]，对熊蜂海藻糖酶研究尚无相关报道。【拟解决的关键问题】以中国广泛分布且具有重要商业化前景的小峰熊蜂（B. hypocrita）为材料，采用同源序列克隆和RACE技术克隆得到小峰熊蜂可溶型海藻糖酶基因（BhTre-1），分析其基因序列特征以及与其他昆虫Tre-1的亲缘关系；利用实时荧光定量PCR分析该基因在工蜂不同组织和不同发育阶段的表达特性，为进一步研究其在授粉昆虫体内的生物学功能奠定基础。

1　材料与方法

试验于2013年12月至2014年5月在中国农业科学院蜜蜂研究所昆虫授粉与生态研究室完成。

1.1　材料

供试小峰熊蜂采自中国农业科学院蜜蜂研究所熊蜂繁育室，饲养温度为（29± 1）℃，相对湿度为（60±5）％，以糖水和花粉进行饲喂，饲养过程中保持全暗环境并避免接触任何化学试剂。

1.2　RNA提取及cDNA第一链的合成

采用Trizol法提取小峰熊蜂工蜂总RNA，用琼脂糖凝胶电泳测定RNA的纯度，利用反转录试剂盒（康为世纪）合成cDNA第一链，然后根据SURPERSWITCHTMPCR cDNA试剂盒（宝盈同汇）合成5′-RACE和3′-RACE cDNA第一链。

1.3　保守区片段扩增

根据NCBI数据库中已公布的地熊蜂（B. terrestris）和B. impatiens Tre-1保守区序列，利用Primer Premier 5.0设计1对简并引物Tre-1-F和Tre-1-R（表1），以cDNA第一链为模板进行PCR扩增，反应体系为：10×PCR Buffer 5μL，dNTPs 1μL，模板1μL，上下游引物各2μL，rTaq 1μL，灭菌ddH2O补足50μL。扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性40s，50℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环后，72℃保温7min。将扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，按琼脂糖凝胶回收试剂盒（中科瑞泰）说明书进行回收、纯化；连接、转化后，挑斑验证正确后送北京宝盈同汇测序。

1.4　cDNA末端快速扩增（RACE）

根据已获得保守区序列，利用Primer Premier 5.0设计4条特异性引物：3′-GSP1、3′-GSP2、5′-GSP1和5′-GSP2（表1）。3′-RACE扩增以3′-RACE cDNA第一链作为模板进行第一轮PCR扩增，引物为3′-GSP1和3AP；第二轮扩增以第一轮PCR产物稀释1倍为模板，引物为3′-GSP2和3AP（表1）。反应体系为：10×SURPERSWITCHTMHot Start Buffer 2.5μL，dNTP Mix（2.5mmol·L-1）2.5μL，模板0.5μL，SURPERSWITCHTMHot Start DNA polymerase 0.5μL，3′-GSP和3AP各0.2μL，灭菌ddH2O补足至25μL。扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸1min，38个循环后，72℃保温10min，第二轮PCR退火温度为59℃。5′-RACE扩增方法和反应体系同上，扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，37个循环后，72℃保温10min，第二轮PCR退火温度为58℃。产物切胶回收、连接、转化和验证方法同上。

1.5　开放阅读框（ORF）扩增

根据所得保守区和RACE片段，预测ORF序列，在其起始密码子近5′端设计特异性上游引物ORF-F1和ORF-F2（表1），在终止密码子的近3′端设计特异性下游引物ORF-R1和ORF-R2（表1），二次PCR扩增BhTre-1的整个ORF区。第一轮PCR以5′-RACE cDNA第一链作为模板，引物为ORF-F1和ORF-R1；第二轮扩增以第一轮PCR产物稀释1倍为模板，引物为ORF-F2和ORF-R2。反应体系同1.4，扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性40s，61℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸10min；第二轮PCR退火温度为59℃。产物切胶回收、连接、转化和验证方法同1.3。

1.6　序列分析

采用BioEdit等软件进行序列分析；分子质量、等电点、信号肽、糖基化位点分析分别采用ExPASy、SignalP 4.1、NetOGlyc 1.0 sever软件在线分析；氨基酸序列比对、同源性分析及系统树构建采用ClustalW和MEGA 5.0分析。

1.7　不同组织和不同发育时期BhTre-1的表达

选择个体大小基本一致的成年工蜂的触角、头、肌肉、足、翅、体壁、中肠、马氏管、脂肪体和卵巢等10个组织部位研究BhTre-1的表达情况；选取幼虫、蛹及0（0日龄为工蜂出房后24h以内的幼蜂）、5、10、15、20、25和30日龄成虫提取总RNA，并制备cDNA模板备用，研究不同发育时期BhTre-1的表达。每个组织部位及发育时期做3个生物学重复。

以Actin-88作为内参基因[30]，采用实时荧光定量PCR方法测定基因的相对表达量。实时荧光定量PCR反应体系为：SYBR®Premix Ex TaqTMII 10μL，上下游引物各0.8μL，ROX Reference Dye 0.4μL，模板2μL，加水补足至25μL，以2μL ddH2O代替模板作为空白对照。PCR扩增反应在Mx 3000P上进行，扩增程序为：94℃预变性30s，94℃ 5s，60℃ 30s，40个循环。每个处理组做3次重复。

1.8　数据处理与分析

采用2-ΔΔCt方法分析海藻糖酶基因的相对表达量，分别将不同组织部位及发育时期中最低表达的数值视为1，其他组织部位或发育时期的表达量以相对于最低表达量的倍数进行分析，结果采用SPSS 13.0单因素方差分析中的最小显著差数法（LSD法）进行分析。

2　结果

2.1　BhTre-1克隆及序列分析

通过中间片段扩增得到750bp左右的片段（图1-A），测序结果为754bp，经过比对初步判断该片段为BhTre-1的部分片段。根据该片段设计特异性引物，RACE扩增后在5′端和3′端均显示1000bp左右的片段（图1-B），测序结果显示5′端939bp，3′端900bp；ORF扩增得到一段约2000bp左右的片段（图1-C），测序结果显示该片段长度为2118bp。该片段与5′端和3′端拼接后得到cDNA全长序列，通过NCBI-BLAST分析发现该序列与地熊蜂BtTre-1的同源性最高，一致性为99％，与其他蜂种的一致性也高达70％以上。

该基因全长3129bp，包含5′端441bp非编码区和3′端945bp非编码区，ORF长1743bp，共编码580个氨基酸；还包含1个mRNA末端不稳定信号（ATTTA）和poly（A）尾巴，但不含有经典的ploy（A）加尾信号序列（AATAAA），有2个特色“标签序列”PGGRFKEFYYWDSY（170—183位）和QWDFPNAWPP（471—480位）及1个甘氨酸富集区GGGGEY（535—540位）；预测的蛋白分子质量为67.16kD，理论等电点为5.95；有1个信号肽结构（1—21位），6个Asn-Xaa-Ser/Thr（N-X-S/T）序列，其中有5处潜在的天冬酰胺N-糖基化位点，分别位于第108、286、338、345和466位；在21—22位有1个切割位点（TDA-AS），综合Wolfpsort和TMHMM软件在线分析，没有发现跨膜区（图2），这与其他昆虫Tre-1性质极为相似，由此确定该基因为小峰熊蜂可溶型海藻糖酶基因，命名为BhTre-1，GenBank登录号为KJ025078。

2.2　同源性及进化树分析

利用ClustalW在线将BhTre-1与其他昆虫Tre-1氨基酸序列比对，发现Tre-1家族具有很高的保守性，拥有许多保守的结构域（图3）。分析结果显示，该氨基酸序列与同为熊蜂属的地熊蜂BtTre-1和B. impatiens BiTre-1的一致性最高，分别为99％和98％；与西方蜜蜂AmTre-1、云南小蜜蜂AfTre-1和大蜜蜂AdTre-1一致性次之，均为78％；与其他昆虫如印度跳蚁HsTre-1（60％）、瘤姬蜂PhTre-1（54％）、豌豆蚜ApTre-1（50％）、褐飞虱NlTre-1（49％）、飞蝗LmTre-1（49％）、赤拟谷盗TcTre-1（49％）和黄粉虫TmTre-1（47％）的序列一致性也较高。

选取有代表性的6种不同目昆虫的Tre-1用MEGA 5.0软件构建系统发育树（图4），采用邻接法进行聚类分析，每个分支进行1000次健壮性验证，数值代表bootstrap估算值。进化树分析显示BhTre-1与BtTre-1、BiTre-1亲缘关系最近，与AmTre-1、AfTre-1亲缘关系次之；膜翅目、鞘翅目、鳞翅目、同翅目、直翅目和双翅目昆虫的Tre-1 bootstrap值大于65％，与同源性分析的结果一致。

2.3　BhTre-1在不同组织的表达分析

qRT-PCR结果显示，在被检测各组织中BhTre-1表达量明显不同（图5），在中肠中表达量最高，其次是马氏管，在其他各组织中表达量较低。

2.4　BhTre-1在不同发育时期的表达分析

在不同的发育时期BhTre-1均有表达（图6），且呈现一定的规律，即从幼虫期到第15天成虫期表达量逐渐升高，第15天时表达量达到最高，之后表达量明显下降。

3　讨论

海藻糖是昆虫体内重要的糖类和能源物质，而海藻糖酶是昆虫体内唯一能够水解海藻糖的酶类，海藻糖及海藻糖酶在昆虫的各种生理活动中具有重要的作用。目前的研究表明大多数昆虫体内都存在Tre-1和Tre-2，有的昆虫如赤拟谷盗（Tribolium castaneum）甚至存在4个Tre-1[31]，虽然这些海藻糖酶基因在不同昆虫及同种昆虫不同组织，不同时期表达特性并不一致，但均在不同程度上参与了昆虫的生长发育及各种生理活动中能量代谢的调控。这使得研制以海藻糖酶为靶标的新型农药来控制和防治某些害虫成为可能，同时，也为根据有益昆虫海藻糖酶的表达特性对其加以相应的保护与利用提供了参考依据。

本研究利用同源克隆及RACE技术，从小峰熊蜂中克隆获得BhTre-1全长cDNA序列，分析得知BhTre-1与其他昆虫Tre-1具有相似的特征，即1个信号肽、1个甘氨酸富集区和2个特色“标签序列”，预测的蛋白分子质量和等电点与大部分昆虫Tre-1相近，但与赤拟谷盗[31]TcTre-1-2的等电点却相差较大。

对不同组织的表达研究结果表明，BhTre-1在中肠中表达量最高，这与大豆蚜[26]、草地贪夜蛾[32]等昆虫Tre-1表达规律相同，其次是马氏管。昆虫中肠是昆虫分泌消化酶、消化食物和吸收养分的主要部位，其生理行为耗能较大，由于海藻糖酶是昆虫唯一能分解海藻糖的水解酶，因而血淋巴中的海藻糖进入肠道后，必须在Tre-1的作用下水解海藻糖，释放能量物质，维持机体各种生理活动的正常运转。而马氏管是昆虫的主要排泄器官，充分与血淋巴接触，BhTre-1在小峰熊蜂马氏管中的功能可能是水解海藻糖为马氏管的扭动提供能量。但也有研究发现在飞蝗的体壁[16]、绿盲蝽的卵巢[33]和烟粉虱的唾液腺[28]中，Tre-1的表达量明显高于其他组织，这可能与Tre-1在不同昆虫、不同的组织中的功能不一样有关。研究还发现BhTre-1在其他如触角、肌肉、翅和脂肪体等需能较多的组织中同样也有表达，但表达量却相对较低，笔者认为这可能与昆虫体内另一种类型的海藻糖酶—膜结合型海藻糖酶的分布有关，这些组织中是否主要由膜结合型海藻糖酶基因来协调昆虫的各种生理活动有待进一步研究。

对不同发育时期BhTre-1的相对表达量研究发现，成年工蜂BhTre-1的表达量高于幼虫和蛹，不同日龄的成年工蜂表达量呈现明显的规律，这与笔者实验室之前研究的小峰熊蜂乙酰胆碱酯酶基因（AchE）[30]、蜂毒磷脂酶A2基因（PLA2）[34]表达规律基本相同，也与熊蜂的肠道微生物的相对表达规律[35]基本一致，BhTre-1与这2种基因的表达及肠道微生物的多样性之间是否存在某种关联，还有待进一步研究。笔者认为该基因可能与小峰熊蜂的生物学行为，尤其是蜂群内部的社会分工密切相关，小峰熊蜂幼虫和蛹基本处于静止状态，各项生理活动并不活跃，因此表达量相对比较低；成年工蜂初期主要参与巢内工作，如帮助蜂王泌蜡、筑巢和哺育幼虫等，随着龄期的增长，各种活动逐渐变多，其表达量也逐渐增长；中期时，更多的壮年工蜂主要担负着食物的采集与蜂群的守卫，耗能相对较大，因而BhTre-1表达量最大。而在工蜂生命后期，其社会分工再次转向巢内，并逐渐衰老，各种生理活动相对减少，因此其表达量再次下降，但BhTre-1的表达情况与蜂群的社会分工是否存在协同发展的关系还有待进一步探讨。

4　结论

克隆得到小峰熊蜂BhTre-1全长cDNA序列，其分子生物学特性与其他昆虫Tre-1一致，该基因在小峰熊蜂中肠中表达量最高，此外，幼虫和蛹的表达量低于成年工蜂，工蜂出房后表达量呈现先升高后降低的趋势，研究结果为阐明BhTre-1在小蜂熊蜂整个发育阶段的生物学功能奠定了基础。

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［发表于：中国农业科学， 2015，48（2）：370-380］