中国明亮熊蜂复合种的分子鉴定及分布特性

刘苹1，2，黄家兴2，*，安建东2，和绍禹1，吴杰2，*

（1.云南农业大学东方蜜蜂研究所，昆明650201；

2.中国农业科学院蜜蜂研究所，农业部授粉昆虫生物学重点开放实验室，北京100093）

摘要：【目的】为了探明中国境内明亮熊蜂复合种Bombus lucorum complex的物种组成及其分布特性。【方法】利用DNA条形码技术对来源于中国境内的明亮熊蜂复合种的223个标本进行了鉴定，并根据鉴定结果分析了各物种的分布特性。【结果】中国境内明亮熊蜂复合种包括地熊蜂B. terrestris、隐熊蜂B. cryptarum、明亮熊蜂B. lucorum和长翅熊蜂B. longipennis。4种熊蜂共获得160条DNA条形码序列，包含36个单倍型，其中B. longipennis单倍型最多，为14个；B.terrestris最少，为3个。B. terrestris和B. lucorum亲缘关系最远，其遗传距离为0.077；B.lucorum和B.longipennis亲缘关系最近，其遗传距离为0.034。系统进化分析（贝叶斯法和最大似然法）表明，4种熊蜂的分化先后顺序为B. terrestris，B. longipennis，B. lucorum和B.cryptarum。4种熊蜂的分布格局不同，平均分布海拔高度由高到低的顺序依次为B. longipennis，B. cryptarum，B. lucorum和B. terrestris。B. longipennis发现于高海拔的青藏高原东部及南部地区，而B. terrestris仅发现于低海拔的新疆西北部边界地带。【结论】本研究探明了中国境内明亮熊蜂复合种的分类地位及其分布特性，为深入研究该类群的资源保护和农业授粉利用奠定了基础。

关键词：明亮熊蜂复合种；隐存种；DNA条形码；遗传多样性；系统进化；分布格局

中图分类号：Q969　　文献标识码：A　　文章编号：0454-6296（2014）02-0235-09

Molecular identification and distribution characteristics of the bumblebee Bombus lucorum complex in China

LIU Ping1，2，HUANG Jia-Xing2，*，AN Jian-Dong2，HE Shao-Yu1，WU Jie2，*

（1. Eastern Bee Research Institute，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201，China；2. Key Laboratory for Insect-Pollinator Biology of the Ministry of Agriculture，Institute of Apiculture，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100093，China）

基金项目：国家自然科学基金国际合作与交流项目（31211130110）；国家蜜蜂产业技术体系建设专项经费项目（CARS-45）；

公益性行业（农业）科研专项课题（201203080-4）；农业国际交流与合作项目（A6950）

作者简介：刘苹，女，1988年生，天津人，硕士研究生，研究方向为传粉昆虫资源学，E-mail：liuping0609@163.com

*通讯作者Corresponding authors，E-mail：huangjiaxing@caas.cn；apis@vip.sina.com

收稿日期Received：2013-12-08；接受日期Accepted：2014-02-07

Abstract　【Aim】To explore the species composition and distribution characteristics of the bumblebee Bombus lucorum complex in China. 【Methods】DNA（COI）barcodes were used to identify larger new samples of B.lucorum complex from China and then the distribution patterns of these species were plotted using these samples. 【Results】B. lucorum complex in China includes four cryptic species， i. e.， B. terrestris， B. cryptarum， B. lucorum and B. longipennis. From a total of 160 COI barcode sequences from the four species，36 unique haplotypes were identified，with the highest diversity occurring within B. longipennis （14 haplotypes）and the lowest within B.terrestris（3 haplotypes）.The longest genetic distance（0.077）was found between B. terrestris and B. lucorum，and the shortest（0.034）was found between B. lucorum and B. longipennis.Phylogenetic analysis of Bayesian and Maximum-likelihood methods showed that the divergence of the four species occurred in the order of B.terrestris，B.longipennis，B.lucorum，and B.cryptarum.Distribution patterns differed among the four species.The mean elevation of the four species ranks from high to low in the order of B.longipennis，B.cryptarum，B.lucorum，and B. terrestris. B. longipennis was found only at high elevation in the eastern and the southern Qinghai-Tibetan plateau，while B. terrestris was found only at low elevation in northwestern Xinjiang.【Conclusion】 This study clarifies the species composition and distribution patterns of the bumblebee B.lucorum complex in China，which will be useful for further studies on resource conservation of these valuable bumblebee taxa and their use in agricultural pollination

Key words　Bombus lucorum complex；cryptic species；DNA barcoding；genetic diversity；phylogenetic relationship；distribution pattern

熊蜂Bombus spp.是一类重要的传粉昆虫，在维持自然生态系统平衡和农业生产中发挥着十分重要的作用（Goulson et al.，2008；Vergara and Fonseca-Buendía，2012）。目前，全世界已知熊蜂种类约250种，其中中国超过110种，为世界上熊蜂资源最丰富的国家（Cameron et al.，2007；Williams et al.，2010；An et al.，2011）。近年来，由于气候变化、农业集约化、城镇化发展和食物源变化等因素，导致世界不同地区熊蜂种群数量明显下降，甚至部分地方出现种群灭绝现象（Williams，1982，2005；Rasmont et al.，2005；Fitzpatrick et al.，2007；Goulson et al.，2008）。因此，如何有效地保护熊蜂资源，探明熊蜂种群下降的原因成为当务之急。准确鉴定熊蜂种类、了解其分布特性及观测种群动态变化是挖掘可利用熊蜂资源的前提，也是保护和利用我国丰富熊蜂资源的重要举措。

熊蜂为农作物授粉每年所产生的经济价值高达数十亿美元（Velthuis and van Doorn，2006；Carolan et al.，2012；Williams et al.，2012a），应用前景十分广阔。目前，大部分商业化饲养的熊蜂种属于真熊蜂亚属Bombus s. str.，该亚属内有许多种类的形态特征非常相似，利用传统的形态学方法很难鉴定。这些形态特征很难区分的种类，通常被称为隐存种（cryptic species）或复合种（species complex）。例如，欧洲的明亮熊蜂B.lucorum、隐熊蜂B.cryptarum和B. magnus无可靠的形态学鉴定特征，多年来一直被称为明亮熊蜂复合种Bombus lucorum complex（Pamilo et al.，1984；Carolan et al.，2012）。东亚地区地形、植被与气候类型多样，熊蜂复合种更为丰富，仅靠形态特征难以区分（An et al.，2011；Williams et al.，2012b），应用分子生物学手段使得熊蜂复合种的鉴定变得更为准确。Bertsch等（2009）利用COI序列成功鉴定了欧洲地区明亮熊蜂复合种，包括B. terrestris，B.lucorum，B. cryptarum和B.magnus。Carolan等（2012）认为B.lucorum，B.cryptarum和B.magnus3种熊蜂的体色型（color pattern）变异非常大，无法利用唯一的体色型加以区分，DNA条形码序列却可以有效地对其进行鉴定。Williams等（2012b）对整个真熊蜂亚属的种类进行修订时发现，仅依靠形态学特征鉴定熊蜂种是不可靠的，且常常会造成错误鉴定，而利用DNA条形码数据可有效揭示种间差异。Vesterlund等（2014）利用PCR-RFLP技术对真熊蜂亚属内4种复合蜂种进行了鉴定，并证明该技术可以有效地鉴定基因组DNA降解的标本。综上所述，相对于传统的形态学方法，分子生物学技术可以更加有效地鉴定熊蜂复合种，尤其是DNA条形码技术不失为一种重要的研究手段。

20世纪90年代，线粒体COI基因序列已被应用于熊蜂系统进化研究中，并被证明是一种有效的方法（Pedersen，1996），但并未形成标准的方法。Hebert等（2003）研究发现线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ基因（cytochrome coxidaseⅠ，COI）中的一段648bp片段，可在DNA水平上区分不同物种，该方法逐步发展并成为物种鉴定的重要依据之一，即DNA条形码技术。目前，DNA条形码作为一种成熟的技术已被广泛应用于昆虫的种类鉴定和系统进化研究当中（Ståhls et al.，2009；Wang and Qiao，2009；Boehme et al.，2010）。

我们利用DNA条形码技术，研究了近年来采自中国境内的真熊蜂亚属明亮熊蜂复合种B.lucorum complex的大量标本，旨在探明该复合种在中国的物种组成及其分布特性，为深入研究该类群的资源保护及开发利用奠定基础。

1　材料与方法

1.1　材料

采集标本时，利用全球定位系统GPS（Garmin 60CS）记录每个采集点的海拔高度、经度和纬度等信息。针插标本保存于中国农业科学院蜜蜂研究所熊蜂标本室。基于2005-2013年的调查数据，根据明亮熊蜂复合种在中国境内的分布特点，选择51个主要分布点的223个标本作为本研究材料。实验用标本由英国自然历史博物馆生命科学系Paul Williams博士依据真熊蜂亚属的形态特征（Williams et al.，2008）鉴定为明亮熊蜂复合种（图1）。除中国境内该复合种的序列外，其余用于构建系统进化关系的序列均由Paul Williams博士提供。

1.2　基因组DNA提取

取复合种熊蜂的右前足或中足，置于1.5mL离心管中，加入液氮冷冻，用研磨棒研磨至粉末状；利用昆虫DNA提取试剂盒Insect DNA Kit（OMEGA Inc.）提取基因组DNA（按试剂盒说明书操作）。提取完成后，取5μL总DNA进行1％的琼脂糖凝胶电泳检测。对电泳检测合格的样品基因组DNA进行编号，存于-20℃备用。

1.3　PCR扩增及序列测定

将提取的复合种熊蜂基因组DNA进行PCR扩增，引物为Hebert等（2004）设计的膜翅目昆虫DNA条形码通用引物LepF 5'-ATTCAACCAAT-CATAAAGATAT TGG-3’和LepR 5'-TAAACTTCTG-GATGTCCAAAAAATCA-3'。反应体系如下：PCR Mix 25μL、10μmol/L引物各2μL、模板DNA 2μL，然后，补足ddH2O至50μL。反应程序如下：94℃预变性5min，然后，94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸1min，共35个循环；最后，72℃再延伸10min。扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，选择阳性扩增送北京博迈德生物技术有限公司双向测序。

1.4　序列分析

利用BioEdit 7.0.9软件对所测得的序列进行校正和拼接，同时，去除低质量序列（Hall，1999）。将处理后的序列利用BOLD V3.6在线平台的物种鉴定功能进行种类鉴定（http：//www.boldsystems.org/index.php/IDS_OpenIdEngine，2013年可访问）。应用Clustal X2对鉴定的序列进行多序列比对（Larkin et al.，2007），结果导入DnaSP 5.0软件，分析单倍型数、单倍型多样性、核苷酸多态性和平均核苷酸差异数（Librado and Rozas，2009）；利用MEGA 5.1软件，统计保守位点数、多态位点数、简约信息位点、单核苷酸变异位点数、平均碱基组成、遗传距离和核苷酸差异（Tamura et al.，2011）。

1.5　系统进化

以B.vagans和B.alpinus熊蜂为外群，利用模型优化分析软件jModelTest 2.1.3获得最优模型（Darriba et al.，2012）。利用MEGA 5.1软件构建最大似然树（maximum-likelihood tree），系统树节点的置信度由自举值（bootstrap value）进行估计，重复次数为1000（Tamura et al.，2011）；利用MrBayes 3.2软件构建贝叶斯系统进化树，世代数为107，老化值为世代数的10％，模型为jModelTest优化所获得的最优模型，各节点的置信度由后验概率（poster probability）进行估计（Ronquist et al.，2012）。利用Figtree 1.4.0进行显示和编辑构建的系统树。

1.6　地理分布分析

根据分子鉴定的结果，结合每个标本的经度、纬度和海拔高度等采集记录信息，利用ArcMAP 10.2软件分析该复合种各种熊蜂的分布特征。

2　结果

2.1　DNA条形码序列分析

实验总共提取到223个熊蜂标本的基因组DNA，利用标准昆虫条形码序列引物进行PCR扩增、测序，共获得了160个标本的DNA条形码序列。经过BioEdit软件校对，所有获得的序列有效长度均为658bp，表明序列所有位点未发现插入或缺失突变。将处理后的序列利用BOLD V3.6在线平台的物种鉴定功能进行种类鉴定，确定为B.terrestris，B. longipennis，B. lucorum和B. cryptarum。4种隐存种熊蜂种的序列碱基组成差异不大，A，T，G和C碱基的平均含量分别为33.5％，43.6％，10.1％和12.8％；其中A + T含量（77.1％）大于G + C含量（22.9％）。利用MEGA软件对DNA条形码序列变异分析（包括两个外群），结果显示，这些序列包含519个保守位点，139个变异位点，77个简约性位点，62个单变异位点。

利用DnaSP软件对序列进行单倍型分析，结果表明，所获得的160个熊蜂标本的DNA条形码序列中共有36个单倍型，群体的单倍型多样性为0.891，平均核苷酸差异为24.975，核苷酸多样度为0.03768。B.cryptarum种内平均核苷酸差异最大（4.816），核苷酸多样度也最大（0.00732），表明其遗传多样性最丰富；B. terrestris平均核苷酸差异最小（0.207），核苷酸多样度也最小（0.00032），表明其遗传多样性较贫乏。长翅熊蜂B.longipennis的单倍型多样度最高（0.827），说明其遗传资源较丰富。采用Tajima's D值中性检验对4种隐存种熊蜂DNA条形码序列进行检验，B. cryptarum，B.terrestris和B. lucorum差异均不显著，符合中性突变，说明这些蜂种历史上未出现过群体扩张，群体大小稳定；B.longipennis的Tajima's D值差异达到显著水平，说明该蜂种历史上出现过种群扩张（表1）。

N：DNA条形码序列数Sequence number of DNA barcodes；H：单倍型数Number of haplotypes；Hd：单倍型多样性Haplotype diversity；K：平均核苷酸差异数Average number of nucleotide differences；Pi：核苷酸多样度Nucleotide diversity；D：中性检验Tajima's test.*：差异显著（P＜0.05）Significant difference at the 0.05 level.

2.2　遗传距离分析

利用MEGA软件Kimura双参数模型对4种隐存种熊蜂种间的遗传距离进行分析（表2），结果表明，种间的遗传距离范围为0.034～0.077。方差分析显示， 4种隐存种熊蜂的遗传距离均达到极显著水平（P＜0.01），说明4种隐存熊蜂种间存在较大的遗传差异。其中，B. terrestris和B. lucorum的种间遗传距离最大（0.077），两者亲缘关系最远；B. lucorum和B. longipennis的种间遗传距离最小（0.034），两者亲缘关系最近。B. terrestris和B. longipennis，B. cryptarum或B. lucorum的遗传距离分别为0.065，0.068和0.077，说明B. terrestris与其他3种的亲缘关系较远。

下三角数据表示遗传距离；上三角数据表示方差分析结果。The lower triangular data represent the genetic distance，while the upper triangle data represent the results of analysis of variance. **：差异达到极显著水平（P＜0.01）Significant difference at the 0.01 level.

2.3　系统进化树

本研究以B.alpinus和B.vagans为外群，利用MrBayes软件对真熊蜂亚属内的蜂种系统进化分析（图2），结果显示，4种隐存种熊蜂的单倍型序列都与已知种（B. terrestris，B. longipennis，B. lucorum和B. cryptarum）的单倍型序列聚在一起，形成不同的分支，说明所分析的标本为B. terrestris，B. longipennis，B. lucorum和B. cryptarum 4种熊蜂，也证明了所获得的DNA条形码序列能够有效应用于隐存种的鉴定。从树图可知，利用MEGA软件的最大似然法和MrBayes软件的贝叶斯法对所测4种隐存熊蜂的DNA条形码序列进行系统进化分析（图3），结果显示，两种系统进化分析方法的结果相似，即4种隐存种熊蜂复合群被分成4大分支，对应于4种隐存种B.terrestris，B.longipennis，B.lucorum和B.cryptarum种群。贝叶斯的后验概率显示，所有种的分支后验概率均大于0.96；最大似然法种的分支自举值均大于92，以上2种分析方法均支持将4种隐存熊蜂分成4个种。在系统树上，B. terrestris处于4种隐存熊蜂的最基部，说明该种分化最早且与其他3种的亲缘关系相对较远；而B. lucorum，B. cryptarum和B. longipennis3种熊蜂形成一个大分支，说明这3种蜂的亲缘关系较近。

2.4　4种隐存种熊蜂种的分布特性

利用ArcMAP软件分析4种隐存种熊蜂在中国的地理分布格局，结果显示：B. longipennis具有单独的地理分布区域，与其他3种隐存种熊蜂的地理分布隔离，在中国分布范围南北跨度大，主要包括青藏高原的南部及东部地区，分布省份为西藏、云南、陕西、甘肃、宁夏，属于东洋区和古北区均有分布的熊蜂种类；B. cryptarum分布于新疆、内蒙古及山西；B. terrestris仅分布新疆西北地区，伊犁河谷以北及阿尔泰山脉；B. lucorum分布于新疆及内蒙古高原，属于古北区的熊蜂种类（图4）。

根据基因鉴定结果，分析每一种熊蜂各个采集地的海拔高度和经纬度数据。结果表明，B. longipennis分布地的海拔高度和经纬度与其他3种隐存蜂种差异较大，其分布地的平均海拔最高，分布范围为1906～4466m，集中分布在2800～4000m，纬度小于38°N；B. terrestris分布地的平均海拔最低，分布范围为762～1408m；B. lucorum分布范围为567～2731m，集中分布在1000～2000m；B. cryptarum分布范围为883～3108m，集中分布在2000～3000m。B.lucorum，B.cryptarum和B.terrestris3种熊蜂分布地的海拔高度和纬度存在重叠区，其中，B.cryptarum集中分布于较高海拔地区，B. terrestris分布于较低海拔地区，3种蜂集中分布在纬度40°～50°N之间（图5～图6）。

3　讨论

熊蜂是一类体色相对多变的社会性昆虫，存在形态特征趋同进化的现象，给传统形态学鉴定带来一定的困难。真熊蜂亚属内存在许多隐存种，如B. lucorum，B. cryptarum和B.magnus复合种一直为该亚属内种类鉴定的争论焦点（Pamilo et al.，1984；Carolan et.al.，2012；Williams et al.，2012b；Vesterlund et al.，2014）。成功区分这些隐存种，对物种的保护和人工利用具有重要的指导意义，而DNA条形码技术不失为一种有效手段（Carolan et al.，2012；Williams et al.，2012b）。本研究首次应用DNA条形码技术对中国4种隐存种熊蜂进行了研究，发现DNA条形码序列能够有效揭示4种隐存熊蜂的差异，DNA条形码序列的碱基组成具有明显偏好性， A + T含量远大于G + C含量，符合蜜蜂科昆虫线粒体基因组和COI基因的序列特征（Crozier and Crozier，1993；Pedersen，1996；Williams et al.，2012b），因此，可以说明本研究中所测序列来源于线粒体，而非核基因序列。所测DNA条形码序列未发现有插入和缺失现象，序列的信息位点丰富，且种间差异明显，表明DNA条形码技术可成功应用于该隐存种复合种的鉴定。

在4种隐存种熊蜂单倍型多样性分析中，B. longipennis的多样度最高，中性检测结果表明B. longipennis在历史上经历过种群扩张，这与该种熊蜂在中国境内的分布广和丰度高有密切关系，而其余3种隐存种熊蜂群体大小稳定，未出现过群体扩张。遗传距离分析显示，B. terrestris与其他3种隐存蜂种遗传距离远，这与作者进行RAPD扩增时，随机引物容易区分B.terrestris与其他3种熊蜂的结果相一致（未发表资料），而B. lucorum，B. cryptarum和B. longipennis3种熊蜂很难利用随机引物进行区分，亦充分说明其分化时间较短，其遗传差异较小，为开发区分3种蜂的特异性分子标记带来困难。

利用真熊蜂亚属内的已知熊蜂种序列与本研究获得的4种隐存种熊蜂单倍型序列构建系统进化树，发现所构建的系统进化树与Williams等（2012b）所构建的系统进化树结构一致，说明所构建的系统进化树可靠。4种隐存种熊蜂的单倍型序列与已知序列的4种熊蜂聚成相应的分支，且后验概率值都高于0.96，说明利用DNA条形码对这4种隐存种熊蜂的鉴定结果稳定。利用最大似然法和贝叶斯法构建4种熊蜂系统进化树，二者所构建的系统进化树结构相似。利用最大似然法构建的系统进化树，表明B. longipennis和B. cryptarum为较晚分化群，但其节点的自举值较低，说明该节点为独立一分支的结论不可靠，贝叶斯法分析表明B. longipennis和B. lucorum为最晚分化群，但其后验概率值只有0.4037，说明该节点为一分支的结论也不可靠，故两种分析方法所构建的系统进化树的结果一致，因此，当利用DNA条形码序列进行真熊蜂亚属的系统进化分析时，较深节点的后验概率小，如需准确获得4种隐存种熊蜂的系统进化关系还需进一步利用其他基因序列进行预测。

对4种隐存熊蜂种的地理分布进行分析，结果发现B. terrestris仅分布于中国新疆的西北部地区。由于该种熊蜂具有很强的入侵性，易于在引入地筑巢及繁殖，与当地熊蜂种类形成食物竞争且易引入异源病虫害，对当地的熊蜂种群造成威胁，故该蜂种已被许多国家列为入侵物种，禁止人为引入（Kingston et al.，2002；Kanbe et al.，2008；Kadoya et al.，2009）。我国内地与新疆被戈壁滩和大山脉天然隔离，因此，在制定熊蜂保护策略上应禁止人为引入该熊蜂种进入内地，防止其入侵，以免对内地丰富的熊蜂资源造成重大威胁。种类分布海拔和纬度均显示，B. longipennis与其他3种隐存蜂种具有明显差异，表现在其分布海拔高、纬度小于北纬38°，因此，可以结合其分布特性进行进一步的人工利用。B. lucorum，B. cryptarum和B. terrestris3种熊蜂的分布海拔高度具有重叠区，而B. cryptarum分布于较高地区，B. terrestris分布于较低地区，故分布海拔高度也可以作为蜂种鉴定的依据之一。但因采集到的标本数量有限，如需精确获得明亮熊蜂复合种4种隐存熊蜂在中国境内的分布格局，还需继续增加标本采集量和扩大标本采集范围。

熊蜂在中国分布范围极广，仅个别地区未发现，是世界上熊蜂种类最丰富的国家，占世界熊蜂种类的46％（潘菲洛夫，1957；Williams et al.，2010），如何有效保护和利用中国丰富的熊蜂资源已成为一大焦点和难题。对熊蜂种类（尤其是隐存种）进行精确鉴定，明确其分布特性，以摸清我国熊蜂资源家底，是指导熊蜂种保护政策制定、合理开发利用的重要依据。本文首次采用DNA条形码技术鉴定和区分了中国明亮熊蜂隐存种，并阐明其各自的分布特性，为其进一步的资源保护和开发利用提供了一定的理论借鉴，这仅是中国熊蜂资源保护和利用工作的起步阶段，对于中国熊蜂的分类、保护和利用仍有大量的研究工作亟待进行。

致谢

中国农业科学院蜜蜂研究所罗术东、周志勇、郭军、徐龙龙等，甘肃养蜂研究所张世文、祁文忠、缪正瀛等，以及宁夏固原市养蜂试验站王彪、褚忠桥等同志帮忙采集熊蜂标本；英国自然历史博物馆生命科学系Paul H. Williams博士馈赠该复合种的部分序列并在形态学鉴定上给予帮助。在此一并表示感谢。

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［发表于：昆虫学报，2014，57（2）：235-243］