第五节　常见成像类型

分子影像学的主要研究方向包括蛋白质分子成像和基因表达成像，其中蛋白质分子成像主要包括受体成像、免疫成像和其他蛋白质成像。

一、受体成像

（一）概述

受体（receptor）是存在于细胞膜或细胞内的能与生物活性分子（药物、激素、抗原、神经递质、细胞黏附分子等）特异性结合并诱发细胞生理效应的生物大分子。绝大多数受体由蛋白质分子构成，细胞膜受体是镶嵌在细胞膜上的结构蛋白。有的受体蛋白只由一条肽链构成，称为单体；有的是由若干条肽链组成的蛋白多聚体。一些受体蛋白的多肽骨架可与寡糖链以共价键连接，称为糖蛋白受体（glycoprotein receptor），通常情况下糖蛋白中糖的含量小于蛋白的量，典型的如去唾液酸糖蛋白受体（asialoglycoprotein receptor，ASGPR）、血小板膜糖蛋白受体等，具有分子识别、细胞黏附、保护与润滑的功能。比如作为细胞膜上的“保安”受体，能够识别多种外来药物或毒素分子，并泵出细胞外，起到保护细胞使其免受外来物质入侵的作用。与受体特异性结合的底物分子称为配体（ligand），大多数配体在极低浓度下（10−12～10−9mol/L）即能 p 糖蛋白（p-gp），引起细胞明显的生物效应。受体的功能在于接受细胞外的特定信号的同时，能够通过激活一系列信号通路，最终表现为电信号的传递、肌肉收缩、腺体分泌、细胞黏附、维持细胞离子强度和渗透压等。受体根据细胞内分布情况可分为细胞膜受体，如乙酰胆碱受体、去甲肾上腺素受体；细胞质受体，如肾上腺皮质激素受体等；细胞核受体，如甲状腺素受体等。根据与配体结合后所触发的信号转导与产生效应不同可分为离子通道型受体、G蛋白偶联受体、基因表达调控型受体、具有酪氨酸激酶活性型受体等（图1-1-5-1）。

（二）受体的生物学特性

1．特异性（specificity）　受体的特异性主要包括结合和分布两方面。配体与受体的结合具有特异性，保证了信号传导的准确性。受体与配体的结合位点称为配体结合域（ligand binding domain），它是由氨基酸残基以特定结构和顺序构成的，对互补的配体分子能高专一性、高亲和力地识别及产生相应生理效应，受体-配体间相互作用主要包括范德华力、离子键和氢键等。受体的分布特异性是指一种受体只能在某种或几种特定细胞类型中表达，这种在细胞或组织中表达的差异是受体成像能够显示受体的空间分布和数量的基础。比如AMPA受体主要在大脑纹状体中分布，且各亚型的分布水平与神经系统相关疾病，如帕金森症（PD）及异动症密切相关。

2．高亲和性（affinity）　受体与其相应的配体结合力很强，即具有高度的亲和性。亲和力大小一般用解离常数（Kd）表示，Kd表示占据一半数量受体所需的配体浓度，Kd越小说明亲和力越高。如一般情况下血液中激素的浓度很低，约10−10～10−8mol/L，但仍足以同其受体结合，发挥显著的生理作用。

3．饱和性（saturability）　受体是细胞组分之一，不同受体甚至同一受体在不同细胞中的数量有很大差异，从几百（每个甲状腺滤泡上的促甲状腺激素受体约为500个）到几万（人肝细胞上生成素受体约为1万～5万个）不等。但在特定细胞中特定受体的数量是一定的，因此一定数量的受体结合的配体是有限的，即可以被配体饱和。如在一个细胞胞浆中的雌激素受体含量只有1千～5万个，数量较少，少量激素就可以达到饱和结合。当配体数量达到一定值时，与受体特异性结合的配体不再继续增多，达到饱和，而非特异性结合则不能被饱和。

4．可逆性（reversibility）　绝大多数受体与配体通过非共价键结合，包括范德华力、氢键、离子键等，作用力强度小于化学键，因此结合是可逆的。其结合与解离受各种因素的制约。如在放射性配体结合实验中，当放射性配体与受体的结合达到平衡时，加入高浓度的非放射性配体，可取代标记配体，使抗体-标记配体结合物的放射性减弱，表现出受体配体结合的可逆性。

5．具有生物活性受体与其他蛋白质最根本的区别是在于其与对应的配体结合后会发挥一定的生理效应。例如多巴胺D1受体激活后，会使腺苷酸环化酶活性增强，环磷酸腺苷（cAMP）水平升高，使G蛋白偶联受体（GPCR）去敏感化，从而释放神经递质。配体又可分为激动剂和拮抗剂，与受体结合后产生效应者为激动剂，不产生效应或阻碍激动剂与受体结合者为拮抗剂（图1-1-5-2）。

（三）受体成像的基本原理

受体成像是指经对比剂修饰后的配体能够与某种受体特异性结合，并可通过体内或体外影像学手段检测受体数量、空间分布、密度等特性。受体成像结合了配体-受体的高度特异性和影像学技术高灵敏度的特性，能无创、实时、全面地对关键受体的表达水平及表达状态进行定性、定量研究，对疾病早期诊断、个性化治疗和判断预后具有重大意义。其中小分子和多肽配体由于分子量较小、构象相对简单，不易产生免疫原性，生物相容性较好，近年来引起科学家的广泛关注。在临床研究中，医生和科学家发现某些受体在病变组织或细胞中表达量特异性升高或降低，区别与普通正常组织。据此，科学家广泛研究了多种配体-受体特异性结合系统，用于疾病的诊断，并用体内外相关实验进行了验证。例如，在非小细胞肺癌，乳腺癌，肝癌等癌细胞中，整合素ανβ3受体过表达；叶酸受体在卵巢癌、脑癌、肾癌、白血病等癌细胞中过表达，而在正常细胞中表达很少。晚期和去势抵抗性前列腺癌（CRPC）致死率较高，是临床肿瘤治疗中一大难题。有研究表明，在进展为CRPC的过程中，很多前列腺癌细胞可能丢失前列腺特异性抗原（PSA），但前列腺特异性膜抗原（PSMA）仍然得以保留，故PSMA是一种很有潜力的前列腺癌分子影像靶标。科学家Pomper通过将小分子配体DCFBC用18F标记，制备了PSMA探针18F-DCFBC，并通过PET/CT与MR双模式成像检测了患者早期前列腺癌，并获得较好的成像效果，有助于前列腺癌早期和转移灶的确定，以及对前列腺癌患者的预后进行有效评估。

（四）活体受体成像的条件

受体活体成像检测需要满足一定的条件：①配体-受体间应具有较强的并且适宜的特异性结合解离常数（Kd），一般认为在0.1～50nmol/L范围内能满足要求。当Kd值< 0.1nmol/L时，表明配体-受体之间的结合力远大于二者之间的解离力，表明亲和力过高，靶受体的影像信号强度与显影剂标记的配体或受体浓度无关，使受体表达定量示踪准确度大大降低；当Kd值> 50nmol/L时，表明配体-受体间解离程度远大于结合程度，即需要大剂量、高浓度探针才能检测到靶器官或细胞的信号，这会导致非靶部位的背景信号大幅上升，信噪比大大降低，降低成像的对比度和准确性。②探针在靶细胞内聚集的量应与靶受体表达量成正相关，当细胞不表达靶受体时，细胞内不应残留成像探针，即靶细胞对探针具有靶向摄取的特性。③对细胞表面或细胞内的靶受体的结合不应该存在倾向性差异。④需要考虑成像配体的手性、空间构象等因素对Kd值的影响，以筛选出配体最优的构型或构象。⑤成像分子标记的配体在血液、组织液等体液中应具有较好的稳定性，即在一段时间内能保持化学结构和空间构象不变，避免在到达靶细胞前即被降解或代谢。⑥探针在成像剂量或浓度内对机体无毒性和免疫原性，以期对正常组织或细胞的不良影响降到最低。⑦探针在到达靶部位前没有明显受到血管通透性、组织间隙流体静压等生理因素的影响。⑧应具有适宜的药物动力学特性，比如较好的组织分布特性和较快的代谢、排泄。最理想的受体成像探针在满足以上要求的同时，还能实时反映靶受体的功能，但目前还没有一种受体探针能同时满足上述要求。

（五）受体成像的不足与展望

在放射化学、分子生物学等相关学科，以及成像设备和技术越发先进的今天，受体成像得到了长足的发展，即便如此，受体成像目前依然面临一些挑战，例如目前受体-配体的结合解离常数的测定主要在体外，相对于体内介质更单一、靶点更明确，然而在体内成像中，会面临更加复杂的环境，如多生物力场的耦合，包括血流剪切力、离子强度、内源性配体的竞争效应、配体与结构相似受体的结合效应（多靶点结合）等，其中内源性配体的竞争会导致靶受体对探针的结合程度减弱，降低成像灵敏度；多靶点结合效应会引起假阳性成像等。上述原因是受体成像从体外到体内研究的关键所在，同时由于动物（常用的模式动物如小鼠，大鼠等）与人类基因、生理构造具有显著差异，如何将动物实验中探针的药物动力学数据和成像数据科学、有效地转化为可供临床研究参考并应用于患者的数据，既是研究的热点和难点，也是分子成像研究学者持续努力的方向。

二、免疫成像

（一）概述

抗原（antigen，Ag）是指能刺激机体免疫系统，产生免疫应答并能与相应的免疫应答产物（抗体或效应淋巴细胞）在体内和体外发生特异性相互作用的物质。抗原的特性包括免疫原性和免疫反应性，免疫原性是指抗原能刺激和活化免疫细胞（T细胞和B细胞），使其产生免疫效应物质或效应淋巴细胞的能力；免疫反应性指抗原与其诱导产生的抗体或效应淋巴细胞能够特异性结合，产生免疫反应。

抗体（antibody，Ab）是指B细胞经抗原刺激活化浆细胞后分泌的一种免疫球蛋白，能与抗原特异性结合，具有免疫功能。抗体在动物体内主要存在与血清中，是介导体液免疫重要的效应分子。抗体是由两条重链和两条轻链构成的，具有“Y”型结构的免疫球蛋白，按照氨基酸种类和排列的不同，可分为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE（图1-1-5-3）。

（二）免疫成像的基本原理

免疫成像的原理是将示踪剂（如核磁成像对比剂、放射性核素、荧光分子等）标记到单克隆抗体（monoclonal antibody，mAb）、多克隆抗体（polyclonal antibody，pAb）或抗体片段上，利用mAb与抗原（如肿瘤表面抗原）的特异性结合，使示踪剂选择性浓聚于靶部位，并使其信号定向特异性增强的一种新的成像方法，是一种能实现疾病的早期定性和定量诊断的新的无创伤成像技术。由于异源抗体分子引入人体会引起超敏反应，且分子量大的抗体容易在血液循环中与生物大分子作用（如多糖、核酸和血浆蛋白）与结合，容易识别为外来物质，导致被巨噬细胞吞噬，因此到达靶部位的抗体较少。目前的免疫成像研究正朝制备小型化和人源化的方向发展。抗体片段化（antibody fragmentation）通过去除某些功能结构域，在保留免疫功能的同时具有与全长抗体不同的特性，比如：①由于无Fc片段，免疫原性较低，不容易受到巨噬细胞的攻击；②分子量较小，易于穿透生理屏障到达靶器官或靶细胞；③能减弱全长抗体的空间位阻效应，提高免疫成像灵敏度；④体内实验时相对全长抗体具有更低的免疫原性；⑤容易修饰放射性核素、荧光分子等。

近20年来，随着生命科学和生物技术的蓬勃发展，以及新成像手段的出现，免疫成像实现了从体外到体内、静态到动态、细胞级别到亚细胞级别、分辨率和灵敏度巨大提升的质的飞跃。这些新技术和新手段包括共聚焦显微镜、双光子显微镜、光活化绿色荧光蛋白、“Brainbow”技术、荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）等。比如双光子显微镜是一种利用近红外光的激光扫描成像技术，通过同时吸收两个低能量光子而产生荧光。由于荧光的激发和发射主要在焦平面内，因此与普通荧光显微镜相比能实现这光学切片，并具有光毒性较小和不易引起光漂白的优势。此外，双光子显微镜的一个主要优势在于能使用波长更长的激光，因而可以更好地穿透组织。根据不同的成像组织，成像深度可达200～1 000μm，克服了普通共聚焦显微镜有效检测深度低（约50μm）的缺点。有学者通过双光子显微镜观察到植入淋巴结中的T细胞在抗原刺激下，在稳定状态下随机迁移形成稳定的集群和动态群的全过程，并录制了延时视频，实现了对在体免疫细胞的实时、无创、动态的成像。未来新一代免疫成像方法的出现，能够在研究活体细胞动力学的同时评估其功能，同时达到前所未有的分辨率，能够实时监测单个细胞在体内的生物学反应，以期以新的方式来研究和解决威胁人类健康的重大疾病，如肿瘤、心脑血管疾病、免疫相关疾病等。因此，功能性免疫成像或许能在未来十年掀起另一场革命。

三、其他蛋白质分子成像

某些功能性蛋白在细胞增殖、代谢、凋亡等生理过程中起着十分重要的作用，通过对比剂标记的，能与其特异性结合的分子（如蛋白质、多肽或小分子物质）标记靶蛋白，能实现目标蛋白的体内外影像学检测。蛋白质分子成像近年来受到许多研究学者的广泛关注，并在成像分辨率、成像方法和探针设计等各方面取得了丰硕的研究成果。随着对蛋白质标记技术不断发展与成熟，蛋白质成像取得了很大的进展，典型的应用包括细胞的增殖、周期和凋亡成像、代谢成像、血管生成成像等。下面就以细胞凋亡和血管生成成像为例，阐述相关蛋白质分子成像原理。

（一）细胞凋亡成像

细胞凋亡（apoptosis）是程序性细胞死亡的生理形式，对器官发育，组织稳态和体内缺陷细胞的去除至关重要，而不会引起相关炎症反应。细胞凋亡取决于对多种细胞内外信号的识别、整合和扩增，其中最重要的凋亡通路包括：①细胞膜表面死亡受体（如Fas、TNF、DR3等）的信号通路的活化，半胱天冬蛋白酶家族（caspases，如caspase8）的激活；②生长因子（如白介素-3）的突然减少，导致线粒体细胞色素C释放进入细胞质，此过程受BCL-2蛋白家族的调控，最终引起caspase9的激活；③caspase8、caspase9激活后引起下游级联反应，如关键蛋白酶caspase3的激活，结果是直接诱导自发产生的细胞凋亡。在细胞凋亡信号末期，磷脂酰丝氨酸（PS）从朝向细胞质的一侧翻转至细胞膜表面，PS在细胞膜外侧的出现是招募巨噬细胞并将其吞噬的重要信号之一，由于膜联蛋白V（annexin V）对其具有高亲和力，可通过显像剂标记的Annexin V对其进行成像。凋亡途径的缺陷可能导致多种疾病，如细胞凋亡减少能导致癌症、自身免疫性疾病等；凋亡增加会导致艾滋病、神经退行性疾病、脑卒中等。因此，通过对胱天蛋白酶caspase3的直接成像或通过膜联蛋白V与磷脂酰丝氨酸特异性结合间接成像，能够在分子水平诊断早期疾病和评估药物疗效。目前已有学者运用放射性核素18F和99mTc标记Annexin V，或通过放射性核素、近红外荧光分子标记含有DEVD氨基酸序列的多肽，能与caspase3特异性结合，通过核素或光学成像技术在动物和人体无创性检测细胞凋亡（图1-1-5-4）。

（二）血管生成成像

血管生成（angiogenesis）是指已有的毛细血管生长和重塑构成新的、复杂的毛细血管和血管网的过程，是一个涉及多种细胞的多种分子的复杂过程，主要包括：血管部位细胞外基质的改变、基底膜降解、内皮细胞芽生、增殖和迁移、新生内皮细胞形成管腔等。生理上的血管生成主要发生在胚胎发育期间、雌性生殖周期、伤口愈合和毛发生长等。在正常情况下（月经周期除外），血管生成通常处于静息状态，并受促血管形成因子（如VEGF、bFGF血管生成素、整合素等）和抑制因子（如血小板反应蛋白、内皮抑素等）的调节和控制。正常情况下两者处于平衡状态，一旦该平衡打破就会使血管生成系统紊乱。血管生成过程的上调或下调会导致多种疾病如癌症、心血管疾病、免疫性疾病和糖尿病等。

近年来肿瘤血管的生成研究备受关注，血管生成是实体肿瘤发展、侵袭及转移的关键步骤，受肿瘤微环境和遗传因素等多种因素调节及影响。由于实体瘤生长和转移过程均需通过血管获得氧和营养，抗血管生成为肿瘤靶向治疗开辟了新的研究思路，使肿瘤学者们意识到全方位立体肿瘤治疗的重要性。血管生成是基本的生理或病理学变化，对血管生成状态的有效评估能够反映肿瘤微环境状况及生物学性质，从而监测肿瘤组织对治疗的反应。但目前在临床实际应用中抗血管生成治疗的效果尚不尽如人意，可能与肿瘤的异质性，肿瘤不同大小、不同阶段的血管生成状态有关。因此，实时监测及个体化治疗是抗血管生成治疗的关键所在。目前对血管生成检测的标准是微血管密度（microvessel density，MVD），但因其有创性、非实时性等缺点而未能成为理想的评价血管生成手段。通过分子影像学方法，利用显像剂，如放射性核素、磁共振对比剂等标记肿瘤血管或促血管形成因子，通过新型成像技术，包括SPECT/CT、PET/CT、光声成像（photoacoustic imaging，PAI）、US等对病变部位进行实时、在体、无创的成像，有助于评估抗癌治疗药效和肿瘤对于药物的反应等。

四、基因表达成像

基因表达是指基因所携带的遗传信息，通过中心法则（基因的转录和翻译），在一系列酶的作用下，将遗传信息转化为具有生物学功能产物的过程。基因表达产物包括核酸（mRNA、tRNA、rRNA）和蛋白质。多细胞真核生物在个体发育中基因表达具有空间和时间特异性，表现为组织细胞的特异性表达和特定时空的基因表达，在每个阶段都受到多层次的精细调控。

基因表达成像是在基因转录和翻译的过程中，利用对比剂标记的探针，能与相关DNA、RNA或蛋白质特异性结合，或被相关酶催化后产生影像学信号，通过非侵入性手段，实时、在体检测特异性蛋白质或基因表达的部位、时间和分布情况，从而实现疾病在分子水平的精准诊断和疗效监测。目前基因表达成像主要由反义成像和报告基因表达成像两部分构成。

1．反义成像（antisense imaging）的基本原理是根据核酸的碱基互补配对，与目的基因的mRNA互补结合、通过一系列分子机制达到抑制或沉默目标基因，下调转录和翻译的过程，或使目标基因显像的目的。目前用于反义技术的小片段核苷酸包括反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide，ASON）、反义寡脱氧核苷酸（antisense oligodeoxynucleotide，ASDON）和反义RNA等。反义成像通过人工合成对比剂-小片段核苷酸偶联物，经体内核酸分子杂交而显示靶基因或靶基因过度表达的组织。例如Didiot等学者通过人工合成ASON和小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA），利用荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization，FISH）实现了对神经元亚细胞级别的基因表达成像，研究证实HTT基因的激活与亨廷顿病密切相关，同时作者也将siRNA导入细胞，体外细胞和体内动物实验表明siRNA将HTT基因沉默后，显著降低了HTT mRNA的转录水平。但由于反义核苷酸易于被核酸酶降解、在体内需达到比较高的浓度才（图1-1-5-5）。

2．报告基因表达成像

（1）概念：报告基因（reporter gene）表达成像是将基因通过载体运送到细胞内，在细胞内进行基因表达，通过标记的特异性配体或酶反应的底物和基因表达生成的受体和酶进行特异性结合达到间接反映基因表达过程的目的。报告基因是指一类在特定细胞、组织器官或个体处于特定时空条件下会表达并使其产生易于检测、且不会影响宿主正常生理活动进行的基因。报告探针（reporter probe）是能与报告基因特异性结合，并能在靶器官或组织聚集显像的分子。报告基因的表达成像通过将报告基因表达产物和报告探针结合，从而提供报告基因表达的内源性转录因子、关键信号分子、表达产物活性水平等一系列信息，属于间接显像策略（图1-1-5-6）。

（2）报告基因的分类：根据报告基因表达产物的不同可分为两类：①以酶为基础的报告基因/报告探针成像体系：包括β-半乳糖苷酶、萤光素酶（luciferase）、分泌性碱性磷酸酶、胞苷脱胺酶、荧光蛋白家族（如GFP和DsRed）等。报告基因编码的酶，能通过受体-配体特异性结合发生相互作用（如内吞进入靶细胞）以及酶促反应催化报告探针，激发探针产生可被检测到的影像信号。以β-半乳糖苷酶为例，其由大肠埃希菌LacZ基因编码生成，能催化乳糖β-1,4糖苷键水解生成一分子葡萄糖和乳糖。以半乳糖邻硝基苯衍生物（ONPG）为底物，在酶催化下生成的棕色物质，能由标准比色法检测酶活性，如果以萤光素修饰的半乳糖苷为底物则可由荧光法测定其活性，并可用流式细胞术（FACS）定量检测单细胞水平报告基因的表达。由于酶促反应具有速度快、能催化多个底物分子、在检测低水平基因的表达方面具有良好的优势和应用前景。②受体和转运体（transporter）为基础的报告基因/报告探针成像体系：报告基因编码的产物是一种受体或转运体，对比剂标记的报告探针能作为配体与受体特异性结合，触发受体-配体介导的内吞作用使对比剂选择性浓集于靶细胞，或作为被转运的底物，被靶转运体识别和内化，使靶细胞中影像信号特异性增高。典型的例子如Arnab等人创新地通过弥散加权磁共振技术（DWI）非侵入地、在体实时检测了人类水通道蛋白（aquaporin-1，AQP1）报告基因的表达，并通过动物移植肿瘤中的基因表达成像证明其在体内的效用（图1-1-5-7）。

Liang等人利用腺病毒作为基因载体，将多巴胺D2受体报告基因转染入肿瘤细胞，并以此肿瘤细胞建立了动物癌症模型，通过放射性核素18F标记D2受体的配体制备了特异性探针18F-FESP，实验证明能通过正电子发射断层成像（PET）对肿瘤细胞中D2R报告基因进行非侵入性的、可重复和定量的成像。

（3）报告基因成像应具备的条件：①报告基因不应在宿主中表达；②报告基因表达产物，如酶、蛋白质等对宿主无害；③报告基因表达产物在宿主中应具有生物活性，如酶的催化活性，受体的特异性识别活性等；④报告探针易于被放射性核素、核磁成像对比剂等标记，且在靶细胞内能保留适宜的时间以用于PET、SPECT、MR成像；⑤报告探针具有较好化学稳定性，以确保在到达靶目标前不被代谢；⑥报告探针分子量不应太大，能穿过生理屏障和细胞膜并在靶细胞中选择性浓集；⑦报告探针不在非转染细胞或器官中聚集，在血液中消除较快，以提高影像学对比度；⑧报告探针本身应无细胞毒性和免疫原性；⑨报告探针的影像信号应与报告基因产物的活性或靶基因表达程度有很好的相关性。

总的来说，分子生物学和纳米科技在近十几年来得到了长足的发展。从蛋白质芯片、蛋白质组学的迅速崛起、人类和老鼠全基因测序基本完成、基因编辑技术的出现，到智能型纳米探针、分子机器人等每一项成果，都能为分子影像学和分子识别开辟新的研究方向以及提供更广阔的应用平台。

（范　阳　李　聪）