第四节　激光拉曼光谱分析法

拉曼光谱（Raman spectrum）是建立在拉曼散射效应基础上的光谱分析法。1928年，印度物理学家C.V.Raman发现了拉曼散射现象，并以此为基础建立了拉曼光谱分析法。开始拉曼光谱法以高压汞灯为光源，产生的谱线极其微弱，因而需要长的曝光时间和较大的样品用量，且只限于无色液体的分析，在很大程度上限制了其发展。直到20世纪60年代随着激光技术的发展，以激光作为拉曼光谱的激发光源后，才使拉曼光谱法得到迅速发展。目前，拉曼光谱法主要用于物质的鉴定和分子结构的研究，广泛应用于生物、材料、医药、食品和化学化工等领域。

一、基本原理

1.拉曼散射

当一束平行单色光照射在溶液上，其中一部分光被吸收，一部分光透过溶液，还有一小部分光由于光子与物质分子的相互碰撞，使光子的运动方向发生改变而向不同方向散射。光子与物质分子碰撞时，可产生弹性碰撞和非弹性碰撞。在弹性碰撞过程中，没有能量交换，光子仅改变运动方向，这种散射被称为瑞利散射（Rayleigh scattering）。在非弹性碰撞过程中，光子不仅改变运动方向，而且和物质分子间有能量交换，这种散射被称为拉曼散射（Raman scattering），相应的谱线称为拉曼散射线，简称拉曼线。

瑞利散射和拉曼散射可用图10-12所示的分子散射能级图解释。处于电子基态的某一振动能级的分子接受入射光子的能量hv₀后跃迁到受激虚态，受激虚态很不稳定，很快返回到原来的能级，并以光子的形式释放出吸收的能量hv₀，这就是瑞利散射。

如果受激分子不是返回原来所在的能级，而是跃迁到电子基态的其他振动能级，并以光子的形式释放能量，则光子的能量就要发生变化，这就是拉曼散射。拉曼散射有两种情况：一种情况是受激分子跃迁到比原来所在能级高的振动能级，因此释放出的光子能量为h（v₀-v），由此产生的拉曼线称为斯托克斯（Stokes）线，其频率低于入射光的频率；另一种情况是受激分子跃迁到比原来所在能级低的振动能级，因此释放出的光子能量为h（v₀+v），由此产生的拉曼线称为反斯托克斯（Stokes）线，其频率高于入射光的频率。根据玻耳兹曼分布可知，常温下绝大多数分子处于电子基态的最低振动能级，所以斯托克斯线比反斯托克斯线强得多。随着温度的升高，斯托克斯线的强度降低，反斯托克斯线的强度升高。

2.拉曼位移

入射光频率和拉曼散射光频率的差值称为拉曼位移（Raman shift）。拉曼线的频率虽然随入射光频率的变化而变化，但拉曼位移却与入射光频率无关，只与物质分子的振动、转动能级有关。不同物质的分子具有不同的振动和转动能级，因而有不同的拉曼位移。因此拉曼位移是表征物质分子振动、转动能级特性的物理量，是进行物质分子结构分析和定性鉴定的依据。

3.退偏比

当入射光是偏振光时，偏振方向和入射光垂直的拉曼散射光光强与偏振方向和入射光平行的拉曼散射光光强的比值，称为退偏比。它表示偏振入射光作用于物质分子后，所产生的拉曼散射光对于原来入射光退偏振的程度。退偏比是反映分子对称性的重要参数，在拉曼光谱中是一个重要的物理量，它与分子的极化率有关。退偏比越接近零，产生的拉曼光越接近完全偏振，分子含有的对称振动成分越多。退偏比越接近3/4，分子的振动含非对称振动成分越多。因此，用激光作为偏振光源测量退偏比是获得分子对称信息的重要手段。

4.拉曼散射光强度

拉曼散射光强度与分子的极化率、光源的强度、样品组分的浓度等因素有关。一般情况下，拉曼散射光的强度与入射光波长的四次方呈反比，所以短波长的入射光激发所产生的拉曼散射光强度较长波长激发的强。当入射光波长等实验条件固定时，与荧光光谱相似，拉曼散射光的强度与物质的浓度呈正比，据此可用于定量分析。

二、拉曼光谱与红外光谱

拉曼光谱和红外光谱均属分子光谱，都是反映物质分子的振动和转动特征的，这是它们的共性。但它们产生的机理却有本质区别。拉曼光谱是由于分子对入射光的散射引起的，红外光谱则是分子对红外光的吸收产生的。红外光谱是以会引起偶极距变化的极性基团和非对称性振动为研究对象，拉曼光谱则是以会引起分子极化率变化的非极性基团和对称性振动为研究对象。某种振动形式是否红外活性，取决于振动时偶极距是否发生变化；而是否拉曼活性，则取决于振动时极化率是否变化。如线性二氧化碳分子有四种基本振动形式，由于简并现象，实际上只有三种不同的振动形式，即对称伸缩振动、反对称伸缩振动和弯曲振动。在对称伸缩振动中，偶极距不发生变化，而极化率随振动而发生变化。因此，它对红外光谱是非活性的，对拉曼光谱是活性的，即在此处无红外吸收，而有拉曼散射；在非对称伸缩振动中，偶极距发生变化，但极化率不发生变化，所以，在此处产生红外吸收，而无拉曼散射；在弯曲振动中，既有偶极距变化，又有极化率变化，对红外和拉曼光谱都是活性的，因此，在此处既有红外吸收，也有拉曼散射。

一般来说，极性基团的振动和非对称性振动使分子的偶极距发生变化，是红外活性的；非极性基团和全对称振动使分子的极化率发生变化，是拉曼活性的。拉曼光谱适于研究相同原子的非极性键振动，红外光谱适于研究不同原子的极性键振动。如极性基团—OH、—C==O等在红外光谱中有强的吸收带，但在拉曼光谱中却没有反映；对于非极性但易于极化的键或基团，如—C==C—、—N==N—等，在红外光谱中根本不能或不能明显反映，在拉曼光谱中却有明显反映。因此，拉曼光谱和红外光谱是相互补充的，两者相互结合可以得到分子结构的完整信息。

三、激光拉曼光谱仪

（一）色散型拉曼光谱仪

色散型激光拉曼光谱仪主要由激光光源、样品池、单色器和检测器组成，如图10-13所示。

1.光源

由于拉曼散射很弱，所以拉曼光谱仪多采用高强度的激光光源，包括连续激光器和脉冲激光器。目前常用的有Ar+激光器（488.0nm和514.5nm）、Kr+激光器（568.2nm）、He-Ne激光器（632.8nm）、红宝石激光器（694.0nm）等。前两种激光器功率大，能提高拉曼线的强度，后两种激光器的辐射能量较低，不易使样品分解，同时不足以激发样品分子外层电子的跃迁而产生较大的荧光干扰。

2.样品池

由于拉曼散射的强度较弱，所以样品的放置方式至关重要。样品池的类型取决于样品的状态和数量。

（1）气体样品：

由于气体样品散射效率低，拉曼信号很弱。通常放在多重反射气槽或激光器的共振腔内。

（2）液体样品：

常量液体样品可用常规样品池，微量液体样品则用毛细管样品池。对于易挥发的液体样品，应将毛细管封闭。

（3）固体样品：

透明的棒状、块状和片状固体样品可置于特制的样品架上直接测定；粉末状样品可放入玻璃样品管或压片测定。

对于极微量样品（≤10-9g），最好先溶于低沸点溶剂，装入毛细管中，在测定前将溶剂挥发。对空气或湿度较敏感的样品，可置于抽真空的安瓿瓶中测定。

样品池或样品架置于在三维空间可调的样品平台上。

为了得到较大的拉曼散射强度，通常使照射在样品上的入射光与所检测的拉曼光之间的夹角为90°，对于液体和固体还可选0和180°。

激光作为光源可使拉曼散射信号增强，但同时也增加了不稳定样品分解的可能性，特别是某些有机高聚物、生物高分子化合物和深色化合物更是如此。这是因为激光的激发线往往在样品的吸收带内，由于它们对辐射快速而强烈的吸收会引起样品局部过热，导致分解。用脉冲激光器作光源可防止或减少这种影响。

防止样品分解的最有效方法是采用旋转技术。该技术是利用一特殊装置使激光光束的焦点和样品的表面作相对运动，以避免样品因局部过热而分解。该技术不仅可以用于固体样品，也可用于液态样品。它除了能防止样品分解外，还能提高分析灵敏度。

3.单色器

由于拉曼位移较小，杂散光较强，为了提高分辨率，对单色器的要求比较高。一般采用多单色器系统，最好的是带有全息光栅的双单色器，能有效地消除杂散光，使与激发波长非常接近的弱拉曼线得到检测。

4.检测器

一般采用光电倍增管作检测器。由于拉曼光很弱，因此，要求光电倍增管要有较高的量子效率和较小的暗电流。为了减小暗电流，提高信噪比，常常对光电倍增管采取致冷措施。最常用的检测器为Ga-As光阴极光电倍增管，其优点是响应范围宽，量子效率高，在可见区响应稳定。

（二）傅立叶变换拉曼光谱仪

傅立叶变换拉曼光谱仪由激光光源、样品池、干涉仪、检测器、计算机等组成，如图10-14所示。从激光器发出的光被样品散射后，经过干涉仪，得到散射光的干涉图，再经过计算机进行快速傅立叶变换后，就得到正常的拉曼线强度随拉曼位移变化的光谱图。

激光光源为Nd/YAG激光器，其发射波长为1.064μm，属近红外激光光源。由于它的能量较低，可以避免大部分荧光的干扰。仪器还采用一组特殊的滤光片，它由几个介电干涉滤光片组成，用来滤去比拉曼散射光强104倍以上的瑞利散射光。以Michelson干涉仪代替色散元件，采用置于液氮冷却下的Ge-Si检测器或In-Ga-As检测器。

傅立叶变换拉曼光谱仪由于采用近红外的激光光源，能量较低，既可以消除荧光干扰，又可以避免某些样品因光照而分解，非常有利于有机化合物、高分子及生物大分子等的研究。此外，该类仪器还具有扫描速度快、一次扫描就可以得到全光谱、分辨率高、波数精度和重现性好等特点。而且，近红外光在光导纤维中传递性能好，在遥感测量上傅立叶拉曼光谱有着良好的应用前景。缺点是由于光源能量低，其拉曼散射信号比色散型激光拉曼散射信号弱。傅立叶变换拉曼光谱仪是分子结构表征的重要工具和手段。

四、荧光干扰的消除

用激光激发分子，不可避免会产生荧光，造成对拉曼检测的强烈干扰。可采用一些方法来消除荧光干扰。①选择适当的激光频率，避免产生荧光的波长，使拉曼线与荧光线分离。②加入荧光淬灭剂如硝基苯及其衍生物、溴化物、重氮化合物等可降低或消除荧光干扰。③分析前采用强光光源如蓝色激光或大功率汞灯照射样品，使其中微量荧光物质干扰降低，但要注意控制功率和时间，不要使样品分解。④通过蒸馏、重结晶、萃取、过滤等分离手段将荧光杂质预先去除。⑤采用时间鉴别技术，利用荧光和拉曼光产生的时间差来消除。拉曼效应是一个瞬时效应，激发光照射后在10-14～10-12秒内即产生，而荧光的产生需10-9～10-8秒，采用特定装置，使用超短脉冲激发和具有电子快门的光电计数器处理，可实现两者的分离。

五、激光拉曼光谱新技术

激光虽然使拉曼效应增强了，但自发拉曼散射光仍然比较弱，因而使拉曼光谱的应用受到限制。随着激光技术和光谱处理技术的发展，一些新的拉曼光谱技术及拉曼光谱技术与其他技术联用被用于分析检测，极大地提高了激光拉曼光谱分析的灵敏度、选择性和抗荧光干扰能力。其中较为常见的有共振拉曼光谱（resonance Raman spectroscopy，RRS）、表面增强拉曼光谱（surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS）、表面增强共振拉曼光谱（surface-enhanced resonance Raman scattering，SERRS）、显微拉曼光谱、相干反斯托克斯拉曼光谱、受激拉曼光谱、时间分辨拉曼光谱、激光光纤拉曼光谱等。这些光谱技术扩展了拉曼光谱的应用范围，因此成为拉曼光谱中比较活跃的研究领域。

1.共振拉曼光谱

其基本原理是共振拉曼效应（resonance Raman effect，RRE）。共振拉曼效应是指当激发光频率与待测分子的电子吸收带频率接近或重合时，某些拉曼线的强度会急剧增大的现象。如果激发光频率接近分子的吸收带，但还未进入吸收带范围时所发生的共振拉曼效应称为准共振拉曼效应。激发光频率进入分析吸收带范围时所发生的共振拉曼效应称为严格的共振拉曼效应。

共振拉曼线的强度一般比通常的非共振拉曼线强度增大104～106倍，因此RRS具有较高的灵敏度，可用于检测低浓度或微量样品；由于RRS中拉曼线的增强是选择性的，与分子中产生电子吸收的基团有关。因此，用RRS可研究大分子的局部结构特点；由于RRE与电子激发态有关，因此用RRS可研究处于电子激发态的分子结构；采用RRS偏振测量技术，还可得到有关分子的对称信息。RRS已在低浓度样品的检测和配合物的结构表征中发挥着重要作用。

RRS应用中存在的最大困难是荧光的背景干扰和局部过热而引起的样品分解。前者可利用荧光和拉曼光产生的时间差，采用时间分辨技术来消除；后者可通过采用脉冲激光光源、样品旋转技术和激光扫描样品表面来解决。

2.表面增强拉曼光谱

将样品分子吸附在某些金属（Ag、Cu、Au等）的粗糙表面或胶粒上，由于散射截面增加5～6个数量级，可大大增强其拉曼光谱信号，基于这种表面选择性增强效应而建立的方法称为表面增强拉曼光谱法。该法可使某些拉曼光谱信号的增强因子达104～108。SERS已成为表面科学、催化、电化学等领域的重要研究手段。

SERS与吸附金属种类和金属表面粗糙度有关。其中金属Ag的表面增强效应最为显著，是最为常用的吸附金属种类。只有当金属表面具有微观或亚微观结构时，才有表面增强效应，这种金属表面的特定形态被认为是产生SERS的必要条件。如当Ag的表面粗糙度为100nm，Cu为50nm时，增强效应较大。目前，关于SERS的理论还不够完善，提高SERS的稳定性、重现性和拓展分析应用范围是目前研究的重点。

表面增强拉曼光谱法在食品药品痕量化学检测中广泛应用，如通过制备表面增强基体，与拉曼光谱技术相结合，为快速检出酸性橙Ⅱ、苏丹红、孔雀石绿、三聚氰胺等食品非法添加剂提供了有效方法。

将SERS和RRS联用即表面增强共振拉曼光谱可进一步提高检测方法的灵敏度。

3.显微拉曼光谱

是将拉曼光谱分析技术与显微分析技术结合起来的一种应用技术。在常规拉曼光谱仪的基础上加上高倍光学显微镜，入射激光通过显微镜聚焦到样品上，可实现逐点扫描，并获得高分辨率的三维拉曼图像。显微拉曼光谱技术具有微观、原位、多相态、稳定性好、空间分辨率高等优点，可获得微米级的单细胞成像图像，获取样品微区有关化学成分、晶体结构、分子取向及分子间相互作用等各种拉曼光谱信息。在化学化工、材料科学、生物医学和药学等领域均有广阔的应用前景。

以共焦光学技术为基础的共焦拉曼显微镜将物镜和目镜的焦点重合于一点，焦平面与样品探测平面重合，排除了非焦点的结构对成像的影响，具有成像清晰、对比度高、信息量大的优点，并可显示物质的三维结构。近场拉曼显微镜用于探测小于波长尺寸物体光学传播近场，分辨率可达纳米数量级，在样品微区结构探测中的应用正在拓展。

4.激光拉曼光纤探针

是将光导纤维传感技术与拉曼光谱结合使用的技术。激光光源经过显微镜的聚焦进入光纤，传导至样品接触的探头部分，与样品作用后产生拉曼散射信号，再经光纤拉曼探头收集，将信号传到检测器获得拉曼光谱。传统拉曼光谱必须把样品放置在测量光路中（样品池）中，而引入光纤探针后，光和信号的传输收集通过光纤来完成。因而极大地简化了传统光谱方法的光学系统，提高光谱仪器的测量范围，特别适用于遥测技术，使得在线分析、实时分析、活体分析、现场监测、多点测量等成为可能。

5.拉曼光谱与其他技术联用

拉曼光谱的另一热点是它与色谱、电泳和流动注射等分析技术联用。拉曼光谱用作色谱的检测器既能获得高分离效率，同时可得到样品的成分和结构信息，其中表面增强拉曼光谱和共振拉曼光谱与色谱技术联用研究比较活跃。如共振拉曼光谱检测果汁中经高效液相色谱分离后的葡萄糖，检出限可达10ng。拉曼光谱与毛细管电泳联用可用于检测水中除草剂百草枯、杀草快等。以银胶和银电极为活性基体的表面增强拉曼光谱与流动注射分析联用，成功地获取到嘌呤和嘧啶类化合物的结构信息。这些联用技术兼具两者特点，应用前景良好。

六、激光拉曼光谱分析的应用

激光拉曼光谱法的应用领域十分广泛，是一种比较有发展前途的光谱分析方法。

1.在物质定性和结构分析中的应用

拉曼位移表征了分子中不同基团的振动特性，因此可以通过拉曼位移的测定对分子进行定性和结构分析。还可以通过退偏比确定分子的对称信息。对于研究有机化合物的结构，虽然激光拉曼光谱的应用远不如红外光谱广泛，但激光拉曼光谱适合水溶液中有机化合物的测定。它适合测定有机分子的骨架，对—C==C—、—C≡C—等红外信号较弱的基团，却有较强的拉曼信号。拉曼光谱还可用来研究高聚物的几何结构、碳链骨架结构、结晶度等。

由于激光拉曼光谱法适合于水溶液体系的研究，因此也是生物大分子测定的有效手段。激光拉曼光谱可以在接近自然状态的极稀浓度下研究生物大分子的组成、构象和分子间的相互作用，甚至可以对样品的原始状态直接进行测定。这是红外光谱无法比拟的优点。因此，激光拉曼光谱法在生物医学研究中具有重要意义。

2.在定量分析中的应用

拉曼谱线的强度与样品的浓度呈正比，这是拉曼光谱定量的基础。但拉曼谱线的强度受仪器和样品等多种因素影响，其中有些因素还难以控制，难以用标准曲线法或直接比较法定量。因此实际工作中可采用内标法定量，即在被测样品中加入一定量内标物，在激光照射下，它也产生拉曼光谱，选择它的一条拉曼谱线作为标准，将样品的拉曼谱线强度与内标物的拉曼谱线强度进行比较即可定量。由于内标物和样品所处的试验条件完全相同，所以各种影响因素可以相互抵消。

激光拉曼光谱有许多优点，可用于许多无机化合物和有机化合物的分析。激光拉曼光谱法能用于水溶液分析，且准确度较高。此外，它还可同时测定多种组分。如以Ar+激光器的514.5nm线为激发线，为双内标，可同时测定和等阴离子。

一些含有硝基苯结构的杀虫剂和杀菌剂在300～400nm范围有吸收带，用Ar+激光器的457.9nm线和488.0nm线为激发线，可获得它们的准共振拉曼光谱，特别在1320～1360cm-1范围有较强的拉曼线。因此，可用准共振拉曼光谱法测定水中各种取代硝基苯衍生物，如2-硝基苯酚、2，4-二硝基苯酚、2-甲基-4，6-二硝基苯酚等。