第八节　偏振荧光分析法

当荧光分子被偏振光激发后发射偏振光。通过测定发射消偏振光而对物质分析的方法称为偏振荧光分析法。这种偏振发射是由荧光分子对激发光子取向的选择和发射光子的取向引起的。实际测得的荧光一般是消偏振的。引起荧光分子发射消偏振的原因较多，而由于荧光分子在激发态寿命期间发生旋转运动而引起发射消偏振最具有研究意义。目前，荧光偏振测定已广泛地应用于生命科学、临床医学、药物分析和环境科学等领域。

一、荧光偏振与荧光各向异性

（一）荧光偏振与荧光各向异性定义

1.荧光偏振现象

荧光偏振（fluorescence polarization，FP）和各向异性（anisotropy）的测量揭示了荧光体吸收光子和随后发射光子的平均角移。偏振度与荧光体转动速度呈反比，可用于测定抗体和抗原的含量。

当荧光分子受平面偏振光激发时，如果分子在受激发时期保持静止，发射光将位于同样的偏振平面。如果在受激发时期，分子旋转或翻转偏离这一平面，发射光将位于与激发光不同的偏振面。如果用垂直的偏振光激发荧光素，可以在垂直的和水平的偏振平面检测发射光光强（发射光从垂直平面偏向水平平面的程度与荧光素标记的分子的迁移率有关）。如果分子很大，激发时发生的运动极小，发射光偏振程度较高。如果分子小，分子旋转或翻转速度快，发射光相对于激发光平面将去偏振化。

2.荧光偏振与荧光各向异性的定义

荧光分子在偏振光激发下，荧光体发射的荧光亦是偏振光。在平行和垂直于激发光偏振方向所观察到的荧光强度I_//和I_⊥是不同的。荧光偏振可以用荧光偏振度（polarization）P和荧光各向异性r来度量。荧光偏振度（polarization）P和荧光各向异性r的定义如前所述（第八章第一节）。

如果在多种荧光体体系中，所测得的荧光各向异性是各种荧光体荧光各向异性的平均值。

3.荧光偏振度的物理意义及其影响因素

假设荧光体在激发态寿命期间未发生旋转运动，其能量也未经转移而损失，那么，所观察到的I_⊥=0，P=r=1。实际上，稀溶液中的荧光体总是满足P≤0.5，r≤0.4。这一现象称为发射消偏振或发射去偏振。

当I_//=I_⊥，P=r=0时，为自然光或非偏振发射，荧光分子运动很快，取向随机。（在稀溶液中）。

当I_//=0或I_⊥=0时，P=±1，为偏振光，荧光分子运动很慢，取向有序。

当I_//≠I_⊥≠0时，0＜P＜1，为生物大分子的荧光属于这种情况。

荧光偏振与荧光体的分子形状、转动速度及温度有关；还与荧光体的吸光对偏振激发的取向、光选择性、激发矩与发射矩是否共线等因素有关。在稀溶液中的荧光各向异性，由荧光体的内在光谱性质决定。因为溶液的黏性越高，越阻碍了激发态分子在发射前的有效旋转扩散，P增加。温度升高，P降低。同时，在极稀的溶液中，可以忽略能量转移或再吸收引起的发射消偏振。

（二）荧光体的激发与光选择

荧光分子可以被看成一个振荡偶极子（oscillating dipole），有内在的吸收偶极矩（absorption dipole moment）和发射偶极矩（emission dipole moment），也称吸收跃迁矩和发射跃迁矩。分子的吸收偶极矩和发射偶极矩的取向取决于分子内电子跃迁本质，即取决于分子的结构。由于荧光分子基态与激发态的电子分布不同，荧光分子的吸收偶极矩和发射偶极矩通常不共线。对于一个荧光分子不发生旋转运动时，吸收偶极矩和发射偶极矩之间的夹角θ是固定的，其夹角θ大小由荧光分子的结构决定（图8-9）。

用偏振光激发一个荧光分子随机取向的体系，吸收偶极矩与光子电矢量平行的荧光分子优先被激发。吸收偶极矩与光子电矢量呈夹角θ取向的荧光分子，其吸收光子的概率与cos2θ呈正比。这种光吸收现象称为光选择。以平行于z轴的偏振光激发荧光体时，激发态荧光体布局是围绕z轴呈对称分布的。

（三）荧光体的偏振光谱

通常情况荧光体的吸收偶极矩和发射偶极矩不共线。如果吸收偶极矩和发射偶极矩间交角为α取向的荧光分子，在各向同性、均匀的玻璃化稀溶液中，荧光发射进一步消偏振，测得的荧光各向异性为：

式中，r₀表示旋转扩散、能量转移及其他消偏振过程不存在的条件下所观测的各向异性，又称荧光体的内在各向异性，其大小是吸收偶极矩与发射偶极矩间交角的度量。不同吸收带的吸收偶极矩的取向不同，因而α值随激发波长而改变，r₀值也随激发光波长而改变。在玻璃化稀溶液中，荧光体的旋转扩散受到抑制，由测量r₀随激发光波长的变化而绘制的谱图称为偏振（激发）光谱，其反映了荧光体吸收偶极矩与发射偶极矩交角随波长变化的情况。通常情况下，各向异性与发射波长无关。如果由不同的电子态发射，得到的不同发射光谱，此时各向异性可能与发射波长有关。

（四）荧光体的旋转扩散与Perrin方程

在稀溶液中，荧光体在激发时发生旋转运动，使发射偶极矩偏离吸收偶极矩，导致发射消偏振。荧光各向异性（r）与荧光体发射偶极矩在激发时的平均角移有关。当用脉冲偏振光激发球形荧光体时，荧光各向异性值随荧光体的旋转相关时间（φ）呈单指数衰变。

式中，r₀为荧光体的内在各向异性；φ为荧光体的旋转相关时间，η溶液黏度；V为旋转体体积；T为温度；R_g为理想气体常数。因此，稳态荧光各向异性的测定即是总荧光强度F（t）权重的荧光各向异性r（t）的平均值，得Perrin方程：

式中，τ为荧光分子荧光寿命（或称延迟时间）。当荧光体体积很大、小分子荧光体键合于大分子上及溶液的黏度很大时，r=r₀；如果荧光体体积很小、溶液黏度小及荧光寿命长时，r＜r₀。但多数情况下荧光体并非球体，即使是球状分子，荧光发射偏振P（t）的衰变也不是呈单指数衰变的。

（五）荧光各向异性的测量

普通荧光分光光度计也可用于测定荧光偏振和荧光各向异性。但需要在激发光路和发射光路中同时插入偏振附件，根据测量需要将激发偏振器和发射偏振器分别设置为垂直偏振或水平偏振。测量荧光各向异性或荧光偏振的方法有L-型法和T-型法，L-型法使用单一的发射通道时更为常用，T-型法常用于建立两个分立的发射通道同时观测平行和垂直的偏振发射时。

二、荧光偏振与荧光各向异性的应用

荧光偏振和荧光各向异性值的测定，提供了与荧光体在激发态寿命期间的旋转运动动力学相关的信息，荧光偏振技术在分子生物学特别是蛋白质变性、酶与底物相互作用研究中获得了越来越广泛的应用。

（一）荧光偏振免疫分析

荧光偏振理论与免疫分析相结合，建立了荧光偏振免疫分析理论与实验方法。荧光偏振免疫分析（fluorescence polarization immunoassay，FPIA）是用小分子荧光体（F）标记抗原（Ag），再联结到大分子蛋白质或抗体上发生特异性免疫反应后，旋转体的体积变大，旋转运动受到抑制，荧光偏振与各向异性显著增大（图8-10）。

若样品中存在小分子的抗原（多数为用药或待测成分），则抗原可能夺走联在抗体大分子上的荧光体，结果偏振度下降。根据荧光偏振程度与小分子浓度呈反比关系，可用于抗原或抗体的测定。通过对荧光偏振或荧光各向异性的测定，为研究抗原-抗体免疫反应、测定抗原或抗体提供理论基础和实验技术。荧光偏振免疫技术被广泛地应用于环境检测、食品安全监督、疾病诊疗和化学、生命科学的相关分析中。

1.环境检测

FPIA在环境监测中有重要的应用，具有灵敏度高、精密度好、操作简单等优势。如，丁草胺是水稻等农作物种植中常用高效的除草剂，但其会对土壤和水体造成污染，尤其对于鱼类呈高毒性，因此，对丁草胺的检测非常重要。传统的检测技术都存在灵敏度不佳、耗时、成本高等缺点，用荧光标记物（如丁草胺半抗原-5-氨基荧光素）对丁草胺进行荧光偏振免疫分析，取得良好的结果，用于对环境中丁草胺的污染情况进行监测。利用此法还可对大米中的丁草胺的残留量进行分析。

2.食品安全检验

FPIA技术在食品安全检验方面也显示了灵敏、快速的优势，如，奥比沙星（orbifloxacin，ORB）是第三代喹诺酮类抗菌药物，对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有较好的抑制作用，被作为兽药广泛使用，检测食品中残留的ORB十分必要。用荧光标记无LOM-BDF对牛奶中的奥比沙星进行FPIA分析，可收到满意的效果。另外，粮食及其制品中的真菌霉素也可以使用FPIA进行检验，尤其适合大量粮食样品的快速检测。在其他农药、兽药及其一些小分子如苯菌灵、阿特拉津等检验中FPIA发挥着巨大作用。尽管FPIA分析技术还有待提高，但其应用前景十分乐观，有实力发展为该领域的主要技术手段之一。

（二）蛋白质体积的测量与蛋白质旋转扩散的表征

应用Perrin方程测量蛋白质的表观体积是荧光偏振测定的早期应用之一。做法是选用寿命匹配的外源荧光分子共价标记蛋白质，以1/r或（1/P-1/3）相对于T/η作曲线，曲线外推延长至与y轴交点得截距1/r₀，r₀即荧光分子的内在荧光各向异性。由曲线的斜率计算蛋白质的体积。

另外，蛋白质被荧光分子标记后，要做旋转运动外，还伴有局部的扩散运动。荧光分子的快速旋转扩散运动导致表观内在各向异性r₀app比不存在旋转运动时的r₀小，实验结果计算出蛋白质的表观体积。如果荧光分子局部的旋转扩散比蛋白质的旋转扩散快得多，表观体积体现的是蛋白质整体旋转运动的体积，因此，表观体积仍然是实际体积的很好估计值。但荧光分子局部扩散旋转与整体运动旋转相关时间差异不大，表观体积将比实际体积显著降低。

（三）荧光各向异性在生物大分子研究中的应用

目前，荧光各向异性对生物大分子的研究集中应用于以下几个方面：

1.描述蛋白质分子中氨基酸的旋转运动及其构象变化

对蛋白质分子中的某个氨基酸的旋转运动及其相关基团的旋转运动状态的描述以及环境对它的影响。如，在不同蛋白质中色氨酸的旋转相关时间各有不同；在不同温度下，色氨酸的旋转运动速度也大不相同；通过色氨酸旋转速率的变化可以推测色氨酸在蛋白中的旋转运动及其构象变化。同理，也可推测色氨酸和蛋白质中其他氨基酸的作用情况。

2.生物大分子与其作用物的相互作用的描述

通过研究蛋白质、核酸等与作用物作用前后的松弛时间变化，可以推测其相互作用情况以及环境因素对它们的影响。Frank等对转铁蛋白与人转铁蛋白受体、单链DNA与六聚DNA-螺旋酶Rep A的作用动力学进行了研究。其他如细胞膜组成顺序的变化及其动力性质的研究，酶分子内部动态运动及其性质的研究，药物与蛋白质之间相互作用研究等均可采用荧光各向异性方法。

荧光各向异性方法在生物大分子研究中的应用处于起步阶段，由于其高灵敏性、动态研究特征及单分子研究等特点，必将成为生物大分子研究中的一种重要研究手段。

（管春梅）