第四节　紫外-可见分光光度法的定性定量分析

一、定性分析

利用紫外-可见分光光度法对化合物进行定性分析时，须将待测试样和标准品用相同的溶剂配成浓度相近的溶液，以相同的条件分别测定其吸收光谱，然后比较两者吸收光谱的一些特征，如吸收峰数目和形状、最大吸收波长、摩尔吸光系数等，若两者非常一致，就可以基本上认为是同一种物质。如果得不到标准品，也可以与文献上的标准图谱进行对照、比较，但要注意其测定条件必须一致。

有机化合物的紫外吸收光谱的吸收带比较宽、数目少，当它们的结构及性质极其相近时，吸收光谱则非常相似甚至相同，因此，利用紫外-可见分光光度法对化合物进行定性分析有一定的局限性。

二、纯度检查

当纯物质与所含杂质的紫外吸收光谱有差别时，就可以用紫外-可见分光光度法检查物质的纯度。检测的灵敏度取决于两者的吸收系数。如维生素C在紫外光谱区域有吸收，其水溶液体系的λ_max为265nm，0.01mol/L HCl溶液体系的λ_max为244nm。而杂质在此区域没有吸收。因此通过比较相同浓度试样和标样在最大吸收波长处的吸光度，从而确定试样中维生素C的含量。

若一种化合物在某一波段的紫外和可见光区域内无吸收或吸收很弱，而杂质有吸收时，则该化合物的生产精制应当进行到规定波长处的吸收系数降到最低时为止。中国药典中有些药物就是以此作为杂质限度检查的依据。此外，有些药物的杂质是通过比色法与杂质对照品比较进行控制的。

利用紫外分光光度法还可以检测DNA样品的纯度，当DNA样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时，会影响DNA吸光度的准确测定。DNA在260nm处有较强的吸收，而蛋白质的特征吸收在280nm处，通常情况下同时检测DNA样品260nm处和280nm处的吸收度值A₂₆₀和A₂₈₀，可大致判断所提取的DNA纯度。A₂₆₀/A₂₈₀的值在1.7～1.9之间，说明提取纯度较好；低于1.7，说明提取的DNA中残留有较多的蛋白质或酚；若大于2.0，说明有RNA污染或DNA链断裂。

三、定量分析

紫外-可见分光光度法主要用于定量分析，其定量依据是Lambert-Beer定律，定量方法主要有以下几种方法。

（一）标准曲线法

配制一系列（5～7个）不同浓度的标准溶液，在待测物质的λ_max处，以适当的空白溶液作参比，逐一测定各溶液的吸光度A。然后以浓度c为横坐标，A为纵坐标，绘制标准曲线，或由试验数据求出直线回归方程及相关系数。

用同样方法配制待测试样的溶液，在相同条件下测定其吸光度A_x，然后从标准曲线上查出与吸光度A_x相对应的试样溶液的浓度c_x，或由直线回归方程计算c_x。

（二）直接比较法

在相同条件下配制标准溶液c_s和待测试样溶液c_x，分别测定它们的吸光度。根据光吸收定律得出：

此法比较简便，但误差相对较大。使用时要注意前提条件，即标准曲线或工作曲线通过原点，分析时还要使c_s与c_x尽可能接近，以提高测定结果的准确性。