第三节　胚胎植入前遗传学诊断实验场所设置及人员要求

胚胎植入前遗传学诊断（preimplantation genetic diagnosis，PGD）实验室的检测过程中，一般涉及聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增及核酸纯化文库富集等过程，任何样本源性污染、扩增产物污染或气溶胶污染都可能导致假阳性或假阴性结果出现。因此，合理规划设计、严格执行物理分区以及实验室通风的要求，强化技术人员的风险防范意识，以及定期质量控制和整改，对保障实验室的正常运行至关重要。

本节针对PGD实验室的场所、各功能区所需仪器设备的基本配置和人员要求进行阐述。

一、场所

1.PGD实验室各功能区的分区原则

原卫生部先后颁发《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》（卫医发〔2002〕10号）、《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》（卫办医疗政发〔2010〕194号）及其附件《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》对于临床PCR实验室的分区及仪器配置做了明确规定，并且原卫生部临床检验中心颁发的配套文件《临床基因扩增检验实验室工作规范》（卫检字〔2002〕8号）中对各区的功能及注意事项做了阐述。

PGD实验室的分区规划设计和工作流程可以参照临床PCR实验室的相关分区设置原则进行。原则如下：

（1）各区独立：

实验室应包括试剂准备区、全基因组扩增区、标本与文库制备区、扩增区与产物分析区等区域。实验室各区域之间，无论是否在使用，物理上应处于永久性的分隔状态，且各区域间不能有空气的直接流通。各区可移动的仪器及物品必须专用。

（2）注意风向：

空气按试剂准备区→标本制备区→扩增（及产物分析）区方向流动。应在有可能出现“污染物”的区域安装排风或通风设施，控制可能存在污染的气流排出实验室，阻止外部可能的环境进入相应的实验区域。各分区可设置缓冲间以控制空气流向，防止实验室内外空气互通。

（3）因地制宜：

实验室的分区设计没有固定模板，必须依据具体情况具体分析。各区之间最重要的是物理分隔。新建实验室应尽可能做到合理、规范、易于管理。旧的实验室可根据原有实验室的分布现状及空间大小进行合理安排。

（4）方便工作：

严格的分区设计是为了在物理上防止污染，同时也应最大限度地考虑各区域分隔设计及空间和区域面积大小的合理性，以及是否方便日常工作。

（5）工作有序、互不干扰、防止污染、报告及时：

通常一个实验室不会只有一个检测项目或检测方法，工作量的差异也可能较大。一个PGD实验室由于检测项目和检测流程的不同而出现相互干扰的可能性也必须要在设计时加以考虑，从而合理安排仪器设备的放置区域和工作流程。

2.PGD实验室通风、清洁及温湿度要求

PGD实验室需恒温、恒湿，因此应检测环境温湿度，保证2小时温差波动＜2℃，并定期进行环境质评等。

（1）通风：

实验区域的通风换气对减少前一次实验产生的污染至关重要，建议各区域内换气次数＞10次/h。如果实验室没有通风系统，则各区须有外通的窗户，安装由室内向室外排气的排气扇，根据排气扇功率大小不同或个数差异设置各区域之间的不同压力。需要严格控制各区域送排风，防止各区域间空气流通，避免扩增产物随空气流动进入非扩增的洁净区。

（2）清洁：

实验区域每天需要保证进行必要的清洁工作，维持各区域的洁净。

（3）温度：

实验室仪器设备放置及运行有相应的温度要求，具体参见仪器说明书。仪器运行时会产热，温度过高影响仪器性能及寿命，因此需要相应的温控设备。精密仪器对温度范围及波动要求更高，如测序仪房间温度应控制在18～22℃，波动＜2℃。此类仪器应避免阳光直射，运行时推荐使用遮光物品。

（4）湿度：

测序区的湿度保持在20%～60%可以使仪器获得最佳性能。位于高海拔等低湿度地区的实验室应注意在实验过程中对需要干燥的步骤进行优化。

（5）震动：

震动过程产热影响仪器设备工作，房门的开关、不稳定的台面均对精密仪器有影响。此类设备应放置在远离人员高频活动区，必要时可加装减震垫。

3.PGD实验室各区的主要功能及工作流程

结合目前PGD技术的需求，可将实验室分为装管区、试剂准备区、全基因组扩增区及核酸制备区、标本与文库制备区、扩增区、测序区以及产物分析区。

（1）装管区：

胚胎活检细胞的转移可以由活检者通过活检针吸取直接打入离心管，但不可避免会加入培养液中的矿物油和蛋白营养成分，影响后续PCR扩增效果。另外，活检者操作过程中一般无防护措施，较易将污染带入管中。因此，在条件允许的情况下，建议在紧邻胚胎培养室附近设置单独房间或区域以接收和转移活检样本。

（2）试剂准备区：

该区用于试剂的配制。试剂准备区是实验室中最“洁净”的区域，不应有任何核酸的存在。该区应为各区中正压最高区，一般建议为+20Pa。

（3）全基因组扩增区及核酸制备区：

两个区均为PGD前期样本制备区。由于全基因扩增起始样本量低，易受外源核酸污染，建议这两个区独立分开。全基因组扩增区一般与试剂准备区通过传递窗相连，建议其压力为+15Pa。若核酸制备区与全基因组扩增区共用缓冲间，核酸制备区压力应低于全基因组扩增区，建议为+10Pa。

（4）标本与文库制备区：

该区主要用于扩增产物制备或其他标本的制备。实验过程应在生物安全柜内进行，防止标本气溶胶的扩散。整个实验过程应佩戴一次性手套，使用带滤芯吸头。如与前一区域有传递窗连通或共用缓冲间，压力低于前一制备区，建议为+5Pa。

（5）扩增区：

扩增区主要使用热循环核酸扩增仪，即PCR仪，扩增获得靶向目的片段或大量测序文库。由于会产生大量扩增产物及气溶胶，必须防止气溶胶向外扩散。一般建议微负压或0Pa。

以上各区如果均配有缓冲间，缓冲间压力可以灵活设置，因为缓冲间的压力设置已经起到了将各区间空气流动有效阻断的作用，缓冲间为微正压则空气不能流出，缓冲间为更低的负压则实验室内气体在缓冲间即被抽走，没有必要再设置各区压力递减。

（6）测序区及产物分析区：

产物分析区是PGD实验室最后一个工作区域，也是打开PCR反应管进行扩增后的产物分析检测的区域。本工作区压力应设置为-5Pa，空气由外向内流入，以防止扩增产物气溶胶流出。因此，本区可不设置缓冲间。

需要强调的是，各区仪器设备及工作服、鞋、实验记录本和笔等都必须专用，不得混淆。此外，每个区域内还应配备紫外线灯以便于对工作后的区域进行照射，从而减少上一次标本检测遗留的核酸及扩增产物污染。

二、仪器

各功能区所需仪器及注意事项如下：

1.装管区

活检胚胎细胞转移所需的仪器设备主要包括体视显微镜、超净工作台、离心机、涡旋振荡器、紫外线灯和专用冰箱等。操作人员做好防护，如佩戴一次性口罩、帽子、手套。每次使用体视显微镜前需清洁超净台台面及显微镜操作台，防止区域内部环境气溶胶对微量细胞的污染。细胞转移过程可使用点样吸头配合单道移液器。装管区内仪器设备应定期使用中性消毒剂或核酸清除剂擦拭及紫外线灯照射。由于培养室内禁止紫外线灯照射，该区域空气净化层流应不与培养室相通。

2.试剂准备区

试剂准备区的仪器设备主要包括微量可调移液器、纯水仪、天平、pH计、离心机、涡旋振荡器、紫外线灯、冰箱、超净工作台等。天平、pH计等高精密度仪器需要定期校准。该区是实验室各分区中最为“洁净”的区域，不应有任何核酸存在，包括试剂中的标准品和阳性对照品。

3.全基因组扩增区及核酸制备区

这两个区的仪器设备主要包括微量可调移液器、离心机、涡旋振荡器、紫外线灯、冰箱、A2生物安全柜。生物安全柜应为外接管道外排风。可采用30%外排、70%内循环的A2二级生物安全柜。外排式生物安全柜有助于防止核酸提取时产生的气溶胶在室内积聚，但不建议使用100%外排的B2生物安全柜，因其对实验室进风量要求高，易导致功能区压力不平衡。实验室建设时要考虑进风量和风速，若安装分体式空调需考虑封口位置，避免干扰生物安全柜的使用。在PGD实验室各区中，核酸提取的标本制备区是直接与大量临床标本接触的区域，因此要注意生物安全问题，应配有洗眼器和急救箱。

4.标本与文库制备区

标本和文库制备所需的仪器主要有移液器、离心机、涡旋振荡器、紫外线灯、冰箱、A2生物安全柜、磁力架、核酸定量仪、水浴温控或杂交箱、生物分析仪或凝胶电泳仪。当上样工作量很大时，应使用多道移液器，并且应使用带滤芯一次性加样吸头，或自动化加样系统替代手动加样，避免人为因素造成的误差。在高通量检测的过程中需要将基因组DNA片段化，常用的处理方法分酶切消化法和超声打断法。PGD中常用酶打断法处理。打断后需要使用生物分析仪、核酸定量仪或凝胶电泳对片段大小和质量进行分析检测。该区及上述全基因组扩增区和核酸制备区内仪器设备都应定期或有明显抑制污染后使用中性消毒剂或核酸清除剂擦拭，但多数此类溶剂会腐蚀仪器，可再用去离子水擦拭仪器表面。

5.扩增区

目前常用的检测方式中除荧光原位杂交外，均需要扩增、纯化、定量等步骤。因此，PCR仪是扩增区的主要仪器，也可在该区放置移液器和超净台，进行二次扩增的简单实验操作。应配备一个不间断电源或稳压电源，以防止电压波动对扩增造成影响。由于该区会产生扩增产物及气溶胶，需使用紫外线灯对PCR仪进行照射，并用去离子水擦拭清洁仪器。

6.测序区及产物分析区

该区所需的设备主要有高通量测序仪、SNP芯片扫描仪、用于Sanger测序的遗传分析仪、服务器、稳压电源等。有些实验室还会使用琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段长度。此外，高通量的检测会产生大量数据，需要配备满足数据存储、分析需要的仪器设备。在硬件上，生物信息分析平台至少需要一台服务器或计算机群，多数高通量测序实验室采用塔式服务器即可满足分析要求。在软件上，还需安装开源操作系统、生物信息分析软件和数据库软件。此外，必须有稳定的网络和供电及制冷设备以保证数据分析稳定运行。随着“云”的出现，生物信息云平台也开始出现，即在云计算支持下的云端数据分析，但目前云平台的数据安全性存在涉及患者信息等隐私问题，数据保存的完整性、安全性是目前云平台临床应用前需要解决的问题。

特别需要强调的是，每个功能区需配备专门的仪器设备和实验用品，并且有明确标记，避免不同功能区直接的仪器设备及物品混淆导致的污染。

三、人员

在整个PGD过程中，从患者突变基因致病性的判断，到PGD预实验，再到胚胎检测数据的分析及质量控制，均需要从事分子生物学、生物信息学或遗传学专业并经过相关专业内容培训经历的专业技术人员。因此，PGD实验室必须建立与本项检测工作相适应的专业技术人员团队。

根据《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》（卫办医疗政发〔2010〕194号），技术人员需要参加各省（自治区、直辖市）临床检验中心开办的临床基因扩增检验实验室技术人员上岗培训班，经过考核合格后方可从事临床基因检测工作。另外，PGD实验室技术人员还应具备母婴保健技术服务人员资质认证，认证项目需包括实验室技术。