第二节 诊疗规范实践中的常见问题
1.脑胶质瘤进行病理学检查及基因检测的意义是什么？
对于脑胶质瘤病人，进行病理学检查是必不可少的。病理学检查包括HE染色、免疫组织化学染色和特殊染色法，神经病理科医师通过形态学读片诊断，判断不同病理级别及疾病类型。其中脑胶质瘤的病理分级是根据细胞密度、增殖程度、核分裂象和核异型、微血管增生，以及变性、坏死等进行判断的。
如“规范”中所说，2016年版《WHO中枢神经系统肿瘤分类》在脑胶质瘤诊断上有了巨大变化，IDH突变、染色体1p/19q联合缺失、人组蛋白H3.3（H3F3A）K27M突变等分子标志物已被写入新版分类中，革命性地取代了单一的组织病理学分类，将脑胶质瘤带入分子诊断与精准医学时代。借助分子病理检测，可以帮助判断肿瘤组织中IDH突变、MGMT（O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶）启动子区甲基化、TERT启动子突变、染色体1p/19q联合缺失以及其他基因异常等，指导区分不同的分子亚型，对脑胶质瘤的预后预测和临床治疗方案制定有帮助。如IDH1突变型GBM的预后较IDH1野生型GBM的预后好。通过FISH法检测1p/19q联合缺失可作为少突胶质细胞瘤的诊断依据及预后预测指标。MGMT启动子区是否甲基化是替莫唑胺化学治疗敏感性的预测指标。而某些靶点的突变可以作为肿瘤靶向治疗的作用位点，如EGFR扩增、IDH1突变、PD-L1等，目前多在临床试验中。
2.大体病理和分子病理在脑胶质瘤诊断中如何整合？
在大部分脑胶质瘤中，大体病理与分子病理相辅相成，共同发挥诊断作用。如2016年版《WHO中枢神经系统肿瘤分类》中的弥漫性星形细胞瘤根据IDH是否突变分为“弥漫性星形细胞瘤，IDH突变型”与“弥漫性星形细胞瘤，IDH野生型”。这是由于传统组织病理学的分类已不能满足临床需要。已有研究报道根据组织病理学诊断的较低级别脑胶质瘤中，一部分较低级别脑胶质瘤会迅速演进为胶质母细胞瘤，其预后相较一般较低级别脑胶质瘤明显差。而在胶质瘤母细胞瘤中，也有一部分预后较好，无法用传统组织病理学分级解释。IDH突变的发现让该问题得到了很好地回答，根据IDH基因是否突变，传统的较低级别脑胶质瘤被分为了生物行为学完全不同的两类。携带此突变的病人预后更好，意味着完全不同的治疗策略。
而在一部分脑胶质瘤中，大体病理已无诊断意义：中线胶质瘤携带H3K27M突变即被归类为Ⅳ级脑胶质瘤，即使有丝分裂象、微血管增生或坏死这些用于大体病理上诊断高级别脑胶质瘤的征象没有被观察到。不仅如此，H3K27M突变型脑胶质瘤可以显示出更为广泛的组织学特征，包括巨大的上皮样细胞和横纹肌样细胞，原始的神经外胚层肿瘤样病灶，室管膜样病灶，肉瘤样转化这些提示恶性程度较高的大体病理特征。而且在弥漫性中线胶质瘤H3K27M突变型中还可能观察到一些提示局限性脑胶质瘤的大体病理征象，如神经纤维样岛，神经节分化和多形性黄色星形细胞瘤病灶。H3K27M突变型脑胶质瘤大体病理的巨大差异有待进一步研究。
3.脑胶质瘤分子病理如何开展，如何选择指标？
脑胶质瘤是指起源于脑神经胶质细胞的肿瘤，是一组具有胶质细胞表型特征的神经上皮细胞肿瘤的总称。传统脑胶质瘤诊断根据肿瘤细胞组织学特征将其恶性程度分为Ⅰ～Ⅳ级，但是常规组织病理学检查显然不能满足术前诊断、指导治疗以及判断临床预后的需求。随着分子生物学的发展，分子病理学检查和诊断日渐兴起，研究发现不同脑胶质瘤的分子分型有很大的不同，预后也相差很大，因此WHO在2016年修订版的《脑胶质瘤诊疗规范》中引入了分子病理学诊断，这些分子标志物的发现与使用对脑胶质瘤临床诊断，个体化治疗和预后判断具有重要意义。
脑胶质瘤分子病理一般是通过肿瘤切除或活检获取标本后，对一些分子标志物进行检测，以确定肿瘤分子亚型。目前常用的分子病理标志物包括：异柠檬酸脱氢酶（IDH）突变、染色体1p/19q联合缺失、MGMT启动子区甲基化、ATRX突变、TERT启动子突变、组蛋白H3K27M突变、BRAF基因突变、PTPRZ1-MET基因融合等。那么如何开展脑胶质瘤分子病理呢？
脑胶质瘤分子病理的开展重点在于检测项目的选择，首先，对于组织学病理检测提示脑胶质瘤的病人，均应进行IDH突变和1p/19q联合缺失的检测。然后对于不同病人应根据病人以及脑胶质瘤具体情况选择合适的检查项目，对中线部位的脑胶质瘤病人考虑进行H3F3A-K27M突变的检测，对年龄70岁以上病人考虑TP53突变、MGMT启动子区甲基化检测，通过以上检测对其预后和治疗方案的选择提供帮助。无手术适应证的病人，可以考虑做BRAF-V600E基因突变检测以便选择靶向药物进行治疗。术后病理难以鉴别的少突胶质细胞瘤或混合性少突星形细胞瘤均应进行1p/19q联合缺失的检测以判断少突胶质细胞瘤成分，KIAA1549-BRAF融合基因还可用于鉴别毛细胞性星形细胞瘤。难以手术，预后极差的GBM病人可以考虑检测EGFR变异等，在病人知情情况下可考虑参加针对性的CAR-T免疫治疗临床试验。无IDH突变的病人可以考虑进一步检测TERT启动子突变以判断预后。因此，在脑胶质瘤病人分子病理检测项目选择上一定要做到有针对性、个体化，不可盲目选择。
除此之外，脑胶质瘤分子病理检测质控也是做好分子病理检测的关键，尤其是脑胶质瘤样本的保存。样本的降解与许多因素相关，必须严格执行标准操作程序和临床实践指南。对于接受过放射治疗、化学治疗的病人，进行分子病理项目检测时应考虑到放射治疗、化学治疗所带来的影响，并考虑到放射治疗、化学治疗可能导致的脑胶质瘤继发性的分子表型改变。最后，肿瘤样本具有异质性，对于用于分子病理诊断样本应当选择性选取与收集。
4.脑胶质瘤分子病理报告如何解读？
脑胶质瘤分子病理近年来取得了重大进展。2016年WHO已将分子病理纳入脑胶质瘤病理诊断体系。基于肿瘤遗传学水平的分子病理能够更准确地指导治疗以及判断预后，并且对组织学难以明确诊断和分级的肿瘤提供鉴别依据。脑胶质瘤分子检测报告基本内容包含以下6个项目：①IDH1/2是否突变；②MGMT启动子区是否甲基化；③染色体1p/19q是否联合缺失；④TERT基因是否出现突变；⑤BRAF基因是否出现突变；⑥其他分子检测指标。
IDH1/2突变的解读：
IDH1/2突变的生物学功能主要是增加G-CIMP亚型相关的2-羟戊二酸的浓度，一般使用IHC焦磷酸测序方法进行检测，临床应用价值主要是在于指导判断预后，存在IDH1/2突变的病人预后较好，野生型病人可以建议进一步检测MGMT启动子区甲基化来预测预后。
MGMT启动子区甲基化的解读：
MGMT启动子区甲基化的生物学功能主要是干扰DNA修复，与IDH1/2突变肿瘤中的G-CIMP相关，一般使用MSP或焦磷酸测序，临床应用价值在于MGMT启动子区甲基化的病人（可能伴有IDH突变）放射治疗、化学治疗有好的疗效。有MGMT启动子区甲基化的GBM（可能没有IDH突变）对烷化剂敏感，对老年病人有预测指导价值，无MGMT启动子甲基化的老年病人不建议辅助化学治疗。
染色体1p/19q联合缺失的解读：
1p/19q联合缺失被认为是少突胶质细胞瘤的分子特征，是其诊断性分子标志物，对疑似少突胶质细胞瘤或混合性少突星形细胞瘤均应进行1p/19q联合缺失的检测，伴有1p/19q联合缺失的少突或间变性少突胶质细胞瘤的病人，推荐TMZ单纯化学治疗或PCV联合放射治疗、化学治疗。
TERT启动子突变的解读：
TERT启动子区的C228T和C250T突变可以增加TERT启动子的活性，导致端粒酶逆转录酶（TERT）活性增加，脑胶质瘤细胞内端粒长度得以维持。因此TERT启动子突变的病人预后较差。
BRAF基因突变的解读：
BRAF基因编码一种丝/苏氨酸特异性激酶，参与调控细胞内多种生物学事件，其临床应用价值主要在于KIAA1549-BRAF基因融合在毛细胞性星形细胞瘤内高发（50%～70%），而在其他级别脑胶质瘤中极为少见。而BRAF V600E突变的脑胶质瘤存在潜在靶向治疗药物，如威罗非尼，因此BRAF基因突变是靶向治疗的标志物。
其他检测指标：
EGFR扩增和EGFR Ⅷ重排，前者在脑胶质瘤中有很高的发生率，并伴有编码蛋白的过表达，可用于小细胞GBM辅助诊断，以鉴别高级别少突胶质细胞瘤。EGFR扩增病人常伴有EGFR Ⅷ重排，导致下游信号的持续激活，其靶向治疗药物和特异疫苗仍需更多临床验证。Ki-67是增殖细胞的核抗原，功能与有丝分裂相关，是标记细胞增殖状态的抗原，其染色活跃说明癌细胞增殖活跃，对于低级别弥漫性脑胶质瘤是一个预测预后的可靠指标。TP53基因是一种细胞周期调节蛋白，在各种恶性肿瘤中普遍存在突变，有TP53突变的低级别脑胶质瘤预后较差。
5.脑胶质瘤病理检测常用的免疫组化染色指标有哪些？有什么临床意义？
GFAP：
胶质纤维酸性蛋白。是胶质细胞表达的中间纤维，用以维持正常星形细胞的细胞骨架。在脑胶质瘤中，GFAP表达随恶性级别的增长而降低，提示它在维持胶质细胞形态和调控星形细胞生长中的重要性。
ATRX：
α地中海贫血伴智力低下综合征X连锁基因。常在星形细胞瘤与继发性胶质母细胞瘤中表达。ATRX的丢失会增加DNA损伤和端粒末端融合的概率，导致端粒持续凝聚和基因组的不稳定性。
IDH1：
异柠檬酸脱氢酶，是一种由IDH基因编码的糖代谢酶。IDH基因有多种亚型，但IDH1基因突变与低级别脑胶质瘤和继发性胶质母细胞瘤密切相关，并且突变病人有较好的临床预后。
H3K27M：
组蛋白H3中第27位赖氨酸突变为蛋氨酸。该位点突变会使H3K27me3失甲基化，其常在弥漫中线分布的儿童脑胶质瘤中表达，预后极差，平均生存时间不足一年。
H3K27me3：
组蛋白H3中第27位赖氨酸的三甲基化。在弥漫性中线胶质瘤（DIPG）中常见。因H3K27M的突变，染色体构象改变，难以结合甲基转移酶PRC2从而使其三甲基化丢失，导致H3K27me3阴性。
Ki67增殖指数：
Ki67抗原为细胞增殖的核抗原，用于判断肿瘤细胞增殖活性。除G0期外，所有细胞周期均有表达。研究显示，Ki67指数与肿瘤分化程度、浸润转移及预后有密切关系。脑胶质瘤一般＞5%，目前无证据提示Ki67与脑胶质瘤预后相关。
6.对于不能做分子检测的基层医院，神经病理的形态学诊断对临床还有价值吗？
随着分子病理检测技术的普及，国内大多数医院都可以开展针对脑胶质瘤的基因检测。而对于不能做分子检测的基层医院而言，传统的神经病理诊断对于临床治疗依然有着重要的价值。首先，可以通过显微镜下形态学诊断确定脑胶质瘤的种类和级别，指导临床的诊断和初步治疗，如是否需尽早放射治疗、化学治疗；其次，可以通过免疫组织化学染色的方法，对某些重要的亚型及分子特征作出诊断，如IDH1免疫组化染色可以较为准确并简便地判断肿瘤中IDH1突变的情况，Ki-67可以作为脑胶质瘤的增殖指数对肿瘤生长情况作出初步判断；另外，基层医院保存的组织切片可供病人借片到有条件的机构进行进一步检测。
目前已有很多研究采用人工智能等方法，通过影像组学或病理形态学判断肿瘤等分子特征，未来的人工智能等方法对基层医院的分子病理诊断会带来非常大的便利。
7.全基因组测序目前对脑胶质瘤诊断和临床治疗的意义何在？
近年来全基因组测序的开展对于发现新的脑胶质瘤分子标志物意义重大，这些标志物（如IDH基因突变）的发现甚至促进了神经胶质瘤诊断的重新分类。2016年版《WHO中枢神经系统肿瘤分类》基于相似的分子遗传学特征，将弥漫性和间变性星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、少突胶质细胞肿瘤及少突星形细胞肿瘤归为一大类，引入了分子亚型（IDH野生型和IDH突变型弥漫性星形细胞肿瘤、间变性星形细胞瘤和胶质母细胞瘤，IDH突变及1p/19q联合缺失型少突胶质细胞瘤和间变性少突胶质细胞瘤）；新增了RELA融合基因阳性型室管膜瘤的分子亚型等。
全基因组测序的飞速发展不仅更新了传统的脑胶质瘤诊断分类，更极大地推动了脑胶质瘤的个体化治疗，能够帮助临床医师针对病人个体制定出最佳治疗方案以及进行最优的药物选择，从而实现精准医疗。
肿瘤基因组图谱（the cancer genome atlas，TCGA）计划，最初的研究目标便是绘制胶质母细胞瘤基因组图谱。与TCGA相对应，中国人脑胶质瘤基因组学数据库（Chinese glioma genome atlas，CGGA）建立了首个针对中国人群脑胶质瘤的高通量NGS测序大数据网络，通过绘制脑胶质瘤融合基因全景图，发现了一系列新的脑胶质瘤分子病理学标志物。该项目首次在继发胶质母细胞瘤中通过全转录组测序构建了包括214个融合基因的全级别脑胶质瘤融合基因谱，发现了重复出现的PTPRZ1-MET融合基因及其4种不同的融合方式。PTPRZ1-MET融合基因是脑胶质瘤恶性进展的关键驱动因子，可导致病人的中位生存期由8个月缩短至4个月。并且CGGA计划进一步筛选出了可靶向抑制该融合基因激酶活性的小分子化合物PLB-1001。
随着全基因组测序的推广应用，针对脑胶质瘤细胞受体，关键基因和调控分子的分子靶向治疗已成为肿瘤治疗研究中的热点，为实施脑胶质瘤的精准医学治疗提供了独特视角与有力工具。
8.不同肿瘤部位之间的异质性对病理诊断的影响是什么？
脑胶质瘤的异质性一直是脑胶质瘤治疗上所面临的重大障碍之一，区域异质性对病理诊断存在着重要的影响，也大大增加了其诊断与治疗的复杂性。脑胶质瘤基因组突变的复杂与多样性更进一步显示出了脑胶质瘤显著的异质性。目前单细胞测序在脑胶质瘤的应用又进一步揭示了脑胶质瘤异质性的复杂程度。2014年Patel及其同事曾对于5个新诊断的胶质母细胞肿瘤中的430个细胞进行了单细胞RNA测序，结果证明，尽管在每个病人个体的GBM中其染色体变异保持相对的保守，但是在基因突变以及基因表达谱上显示出了惊人的区域异质性。来自同一个病人的肿瘤细胞表现出不同的转录本特征，涉及细胞信号传导、缺氧等基本转录特征，脑胶质瘤干细胞的转录本特征，胶质母细胞瘤的转录本特征等，还有一些细胞显示出了混合的基因表达特征。目前越来越多的单细胞水平的研究更是进一步证实以上结果以及强调了脑胶质瘤的区域异质性的复杂性。
这样的区域异质性使得病理诊断存在着局限性。病理检测并不能检测肿瘤样本的每个部位，无法全面检测肿瘤样本。特别是目前的脑胶质瘤的诊断越来越依赖于分子病理，分子标志物对脑胶质瘤的个体化治疗及临床预后判断具有重要意义。分子病理存在着较大的区域异质性，导致所作出的病理诊断其实是依赖于脑胶质瘤某个区域所作出的，不能全面地代表病人脑胶质瘤的总体分子特征。因此根据这个区域病理诊断所进行的脑胶质瘤的分类与分级以及接下来所制定的治疗方案都只能称为是对此区域的脑胶质瘤的精准治疗。
综上可以看出，脑胶质瘤的区域异质性使得病理诊断无法全面地对于肿瘤特征作出评估，显示出了病理诊断的局限性，对于脑胶质瘤的诊断与治疗都提出了很大的挑战。
9.2016年版《WHO中枢神经系统肿瘤分类》中脑胶质瘤病理诊断主要有哪些更新？
2016年版《WHO中枢神经系统肿瘤分类》脑胶质瘤病理诊断相比较于2007年版有大量的更新，最主要的变化就是在传统组织学特征基础上增加了分子病理来诊断脑胶质瘤，结合分子基因特征重新定义了部分肿瘤或者亚型，删除了部分肿瘤类型或诊断术语，增加了部分新认识的肿瘤、亚型与模式，调整了部分肿瘤的诊断标准与分类。将表型和基因型特征整合起来，有助于增加脑胶质瘤诊断的准确性，帮助改善病人的诊断治疗与管理。
新的诊断需要依赖于分子病理，举几个例子来说：①整合表型和基因型特征重新定义了弥漫性脑胶质瘤。最显著的改变是基于共同的IDH1和IDH2基因突变，将所有的弥漫性脑胶质瘤，无论是星形细胞瘤还是少突胶质细胞瘤，都归为一组。少突胶质细胞瘤的确诊需要联合分子病理特点，需要IDH突变与1p/19q联合缺失的同时存在才可进行诊断。②将WHO Ⅱ级即弥漫性星形细胞瘤和WHO Ⅲ级间变性星形细胞瘤在新的分类方式中分为IDH突变型、IDH野生型和NOS型三类。不推荐少突星形细胞瘤的诊断，几乎所有兼具星形细胞瘤和少突胶质细胞瘤组织学诊断的少突胶质细胞瘤都可以通过分子病理学诊断确诊为星形细胞瘤或者少突胶质细胞瘤，在缺乏分子病理的情况下才将具有此类特征的肿瘤诊断为NOS型少突星形细胞瘤（WHO Ⅱ级）或者间变性少突星形细胞瘤（WHO Ⅲ级）。③将胶质母细胞瘤分为：IDH野生型，为原发型胶质母细胞瘤；IDH突变型，为继发型胶质母细胞瘤；还有NOS型，是无IDH检测结果或者检测结果不完整的胶质母细胞瘤。④对于儿童弥漫性脑胶质瘤，借助分子病理检测发现一个可以精准分类的类型，即H3K27M突变型。对于其他类型的肿瘤也在分子病理的基础上进行了新的分类、分层。
综上，2016年版《WHO中枢神经系统肿瘤分类》首次将分子特征纳入脑肿瘤诊断中。这样的组织与分子病理整合的分类方式，对于脑胶质瘤的命名、分类、分级以及报告模式等多个方面进行了系统性的修改，结合这些重要的分子病理特征后的分类可以更好地预测预后，对脑胶质瘤的精准诊疗具有重要意义。但是这种整合了组织学和基因特征的诊断方法增加了结果不一致的可能性，还有众多分子病理等待被发掘以及进一步阐述其意义，未来还需要进一步的发展与完善。
10.立体定向穿刺活检时快速病理确诊脑胶质瘤的准确性如何，是否有办法提高？
立体定向穿刺活检是脑肿瘤，尤其当肿瘤深在、影像学不典型、病人无法适应开颅手术等各种情况下，获取病理、明确诊断、指导后续临床治疗的有效手段。相当一部分比例的脑胶质瘤隐匿起病，尤其是较低级别脑胶质瘤，影像学表现多样，术前诊断不能明确。
意大利米兰大学报道了一组140例无框立体定向导航下穿刺活检，诊断成功率为93.6%，其余无法诊断。另一组来自意大利的421例深部脑肿瘤穿刺活检报道诊断率为97%，有3%无法诊断，并发症发生率为3%，死亡率为0.7%。墨西哥国立神经病学神经外科研究所报道了23例后颅窝肿瘤立体定向活检的临床病例，其中与术前诊断符合者占43.5%，有17.4%无法作为诊断。对于低级别脑胶质瘤，术中快速冷冻往往报告为：胶质增生，给术中是否要进一步采样提出挑战。复旦大学附属华山医院脑胶质瘤团队采用MRS指导导航穿刺，提高采样阳性率；对于一些困难病例还可以采用术中MR确认穿刺部位。美国费城骨科医院神经外科提出了荧光指导穿刺。
前述报道也发现脑胶质瘤穿刺活检的比例近年来明显下降，分析其主要原因之一在于穿刺活检无法满足分子病理诊断的需要。近年来关于快速分子病理检测也得到了很大的发展，美国科学院院士Cooks Graham，以及复旦大学附属华山医院脑胶质瘤团队等都开发了快速质谱实现术中快速诊断IDH突变的技术。IDH突变有望指导鉴别低级别脑胶质瘤和胶质增生。随着检测技术进步，分子检测对于样本量的需求越来越少。采样准确性的提高、分子诊断技术的协助，都有助于提高穿刺活检成功率。
当前，穿刺活检还面临着液体活检和影像组学迅速发展的挑战，但其未来仍有巨大的发展空间，微创、多点、结合分子诊断，都是未来可能的发展方向。
花玮（复旦大学附属华山医院）