三、自噬在生物电场引起的角质形成细胞定向迁移中的作用

正常皮肤中的极性上皮转运存在方向性，细胞可将阴离子（主要是氯离子）转移到角质层中，阳离子（主要是钠离子）转到基底层。基底层阳离子多，顶端阴离子多，由此产生跨上皮电势差（TEP）。TEP在生物体内广泛存在，皮肤创面形成后，跨上皮电势差消失，同时立即产生内源性的直流电场（EF）。该直流电场以创缘为正极，创面中心为负极。创缘的电流强度较创面中心强，且随伤后时间延长而逐渐增加，在伤后大约120分钟达到顶峰，此后在创面修复的全过程中持续存在，作为重要的微环境因素影响角质形成细胞的生物学行为。研究表明，创面修复过程中，角质形成细胞从创缘向创面中心移行，而生物电场则是介导细胞方向性迁移的关键信号。

创面修复过程中，角质形成细胞经过一系列复杂精细的程序由静止态转换为运动态，细胞间黏附分子减少，细胞骨架蛋白重组，从而使细胞获得迁移能力，启动再上皮化，随后细胞继续向创面中心迁移，完成再上皮化。如前文所述，我们发现电场可以促进角质形成细胞启动，发生EMT，运动性增强，但随后电场促进细胞继续定向运动的具体机制并不明确。在迁移过程中，细胞朝创面中心一端的骨架蛋白聚合，前端细胞膜突出并伸出片状伪足；伪足与细胞外基质相互作用，通过黏附蛋白及黏着斑复合体等分子，使伪足锚定在外基质中，固定细胞；随后细胞朝创缘一端的黏着解离，随着细胞体的收缩，纵向延伸，细胞向创面中心迁移运动。细胞骨架及细胞黏附等过程协调运作，提供趋动力，推动细胞不断向创面中心迁移，最终覆盖创基，封闭创面。

自噬是一种广泛存在于真核生物细胞中的现象，参与细胞多种生理过程、信号通路等。在正常情况下，细胞可维持一个较低的自噬水平，该基础水平可维持细胞内环境稳定。低氧、饥饿、紫外线照射、药物作用等应激环境可诱发自噬活性增加。自噬可以分为大自噬、小自噬和分子伴侣介导的自噬。大自噬是由来源于内质网的双层膜结构环绕，包裹待降解物后与溶酶体融合，形成自噬溶酶体，降解其中的物质；小自噬则是由溶酶体的膜突起，直接包裹待降解物，并与溶酶体融合后进行降解；CMA则是通过分子伴侣结合特定的蛋白，将其转运到溶酶体后进行消化，该过程通过分子伴侣对待降解物进行特定选择，这是与大自噬、小自噬最大的区别。大自噬在真核生物细胞中普遍存在，与多种生命活动、疾病、衰老等密切相关，故受到了广泛关注。本课题研究的自噬为大自噬，在本文中以自噬简称。

自噬体可以包裹多余或受损的细胞器、错误折叠的蛋白、多余的脂类、核苷酸等物质，将它们消化、降解为游离氨基酸、核苷、磷酸、甘油和脂肪酸等。这些小分子物质被重新释放到胞质中，为细胞提供能量及原料，参与物质合成及代谢，维持细胞稳定。除了可分解细胞器及胞质内容物外，自噬还可以降解细胞胞吞的物质，包括病原体，帮助机体抵抗感染。除了基础生物及生化外，自噬的研究已经扩展至临床疾病病理的研究，例如自噬与肿瘤、神经退行性疾病的关系。由于临床疾病发展和自噬过程、调控的复杂性，自噬在临床疾病中所扮演的角色十分复杂，并非单一的“黑”或“白”，例如自噬在肿瘤中就发挥着“双刃剑”的作用。首先，自噬可以降解突变基因、受损蛋白，控制有害物质的积累，防止细胞癌变；其次，在某些肿瘤（如肺癌）形成之后，细胞具有较高的自噬水平，通过自噬降解细胞外基质的某些成分，降低细胞的黏附，增加其运动能力，同时高水平的自噬有利于细胞在迁移过程中的存活，促进肿瘤转移。自噬的“双刃剑”角色可能与细胞类型、细胞周期、肿瘤阶段、自噬激活程度密切相关，说明自噬所发挥的作用与具体环境密切相关。

为了实现有效的细胞迁移，细胞黏着斑解体，且这种分解是决定细胞运动速度的关键因素，研究表明，由NBR1介导的自噬可降解局部黏附组成成分，使黏着斑解体。Mowers EE指出，黏着斑蛋白PXN（桩蛋白，paxillin）是一个至关重要的脚手架和信号整合器，它可以通过保守的LC3结合区域（LIR）与LC3B直接结合，促进黏着斑解体和细胞迁移。Zhao等发现抑制自噬可通过ROS/HO-1通路抑制卵巢癌细胞迁移。另外，饥饿诱导的自噬可增加β1整合素和自噬溶酶体的共定位，引起β1整合素到溶酶体的转运增加，迁移下降，但这种现象存在于完全剥夺营养的极端条件下，是否可以类推至其他生理情况仍不确定；而另外有研究指出β1整合素转运到溶酶体中可促进细胞移行，而非抑制运动能力，这些相反的结论可能与处理措施、饥饿程度等因素相关，但可以确定的是，在细胞迁移过程中，自噬参与调控并影响细胞迁移。

创面修复过程中，角质形成细胞经过一系列复杂精细的程序转换为具有间充质表型的细胞，通过减少细胞间黏附分子、细胞骨架蛋白重组、特定基因转录翻译调节等获得迁移能力，从而实现再上皮化。作为创面再上皮化的起始步骤和关键限速环节，角质形成细胞的迁移能力受到了广泛关注。研究表明，角质形成细胞迁移功能受损会引起创面不愈，是形成慢性创面的重要原因之一。

创面修复过程中，角质形成细胞受到内源性电场的影响，发生EMT，获得运动能力，启动移行过程。随后经过伪足形成、胞体收缩、黏附解离等过程纵向延伸，从创缘向创面定向迁移。电场是决定角质形成细胞定向迁移的关键因素，既往研究仅探索了电场如何决定细胞迁移的方向，并未研究电场如何促进细胞定向迁移速度。我们首先证明电场可促进角质形成细胞的细胞运动性并引起定向迁移。其次，发现电场可引起细胞自噬水平显著增加。但自噬是一个动态过程，这种增加可能是自噬生成增加，或是由自噬流受损所导致的自噬体累积，也有可能上述两种原因共同存在。自噬流是否通畅关系到自噬对细胞的作用结果，故我们通过进一步的研究证明加电时自噬生成增加，细胞中溶酶体可正常酸化，自噬体和溶酶体顺利融合，溶酶体可正常降解底物，自噬流通畅，不存在由于自噬流受损导致的自噬累积。通过siRNA敲除自噬关键基因ATG5后，电刺激不再引起细胞自噬水平增加，而细胞定向迁移速度显著下降，运动的方向性无变化，说明外加直流电场处理可通过自噬促进角质形成细胞定向迁移能力（图5-13）。

图5-13　自噬调节电场条件下细胞定向迁移速度

自噬是通过溶酶体降解、再利用自身受损的细胞器和多余的大分子物质的一条主要分解代谢途径，降解的底物可以提供能量和重建细胞结构。自噬在进化上高度保守，存在于所有真核细胞中。研究表明，自噬在许多重要的生物学过程中都发挥了多重作用，参与生物发育、分化、死亡、衰老、免疫，也有证据证明自噬和某些疾病如肿瘤、神经退行性疾病的发生、发展有关。自噬建立的降解-再利用动态循环是细胞保护的关键机制，可以帮助机体应对各种应激。除了在代谢应激时发挥保护作用之外，基础水平的自噬还可维持细胞稳态，是细胞内质量控制的机制，它可以将错误折叠的蛋白和受损的细胞器降解。自噬功能受损的细胞，包括肝细胞、心脏细胞、神经细胞等，都会出现蛋白聚集、包含物小体积累；小鼠肝脏敲除ATG7时会出现肝大，神经细胞敲除ATG7后则会出现神经退行性变。在胚胎发育的不同阶段，自噬出现不同程度的激活，参与特定组织的分化。自噬还可以调节机体固有免疫和获得性免疫，与坏死、坏死性凋亡、细胞迁移、肿瘤侵袭转移有关。

黏着斑、整合素家族、黏着斑激酶和Rho家族相关蛋白等在细胞迁移过程中发挥着重要作用。自噬可参与黏着斑中脚手架蛋白、信号整合器的降解，整合素家族中的重要成员β1整合素可以转运到溶酶体，影响迁移。另外，自噬也与细胞骨架的重组及分布有密切关系。这些现象都说明自噬在细胞迁移中发挥重要作用。本实验中，下调自噬水平后，细胞对电刺激的定向反应仍然存在，运动方向性好，与对照细胞无统计学差异；细胞定向迁移速度显著下降，说明自噬在细胞侧向爬行的过程中发挥关键作用。角质形成细胞迁移包括伪足形成、胞体收缩、黏附解离等过程，自噬具体参与了哪一过程的变化尚不清楚，需要进一步进行研究。

在再上皮化完成后，细胞迁移不再是焦点，取而代之的是细胞的重塑、分化。在这个过程中，细胞形态发生改变，细胞器减少。既往研究发现自噬参与了特定组织的分化，比如红细胞和T细胞在成熟分化时，细胞内线粒体数目减少，这一过程就是由自噬实现的，自噬缺陷则会导致线粒体堆积。另外，自噬也参与脂质小滴的形成、神经母细胞瘤分化、神经胶质瘤干细胞分化、祖细胞分化。因此我们推测自噬也参与角质形成细胞的重塑和分化，但自噬通过何种途径改变细胞状态尚未可知；另外细胞中有多种类型的自噬，不同类型的自噬发挥了何种特异性功能以及其调节机制也不清楚，都需要进一步的研究。

自噬作为重要的代谢途径，在多种重要的生物学过程中都发挥了多重作用，多种疾病例如肿瘤、神经退行性疾病的发生、发展都与自噬异常有关。若想通过调节自噬达到治疗疾病的目的，就必须注意过多或过少的自噬都对人体有害。如果想通过加强电场条件下细胞自噬水平来促进细胞迁移速度，加快再上皮化进程，就必须全面了解电场调节自噬的机制。自噬精细复杂的调节网络也将成为治疗的难点，表观遗传层面的修饰如组蛋白过度乙酰化或者甲基化都会影响ATG基因的表达；转录层面的调节包括 FOXO家族、E2F家族、NF-κB通路等，翻译后调节又包括磷酸化、乙酰化等修饰，除此之外还包括蛋白与蛋白之间的相互作用。这些调节机制相互影响，形成一个复杂的网络，所以电场调节自噬机制的研究仍任重道远。

总之，外加直流电场处理可引起角质形成细胞发生定向迁移，迁移速度增加，自噬生成增加，细胞中溶酶体酸化正常，自噬体和溶酶体顺利融合，溶酶体可正常降解底物，自噬流通畅；下调细胞自噬水平不影响细胞运动的方向性，但可显著影响细胞定向迁移速度，降低自噬水平可导致运动能力下降，说明外加直流电场处理通过自噬促进角质形成细胞的定向迁移能力。