一、低氧通过下调CD9水平促进表皮细胞迁移

CD9属于四次穿膜蛋白（tetraspanin）分子家族成员，最先被发现表达于造血系统细胞中，随后又被发现表达于多种类型细胞中，参与多种细胞生物学过程，包括调节精卵融合、肿瘤迁移、细胞运动性及黏附分化等。使用CD9单克隆抗体或siRNA下调CD9表达均可促进人黑色素细胞的运动性，并且CD9可负调控施旺细胞及内皮的迁移。然而，CD9的下调对黑色素瘤细胞运动性却起抑制作用，且瞬时高表达CD9可促进黑色素瘤细胞在基质胶中的侵袭能力。这些研究表明CD9对细胞的迁移或运动性的作用在不同的细胞中存在差异。

建立小鼠皮肤全层创面愈合模型，对正常皮肤（0天）、伤后3天、5天、7天及10天创面标本进行免疫荧光染色，发现表皮细胞CD9呈U形表达变化，即创面形成后CD9的表达先下降后升高至正常水平，表明CD9与创面表皮细胞表型转换有关（图5-6）。CD9基因敲除的小鼠，皮肤创面愈合速度明显受抑制，细胞增殖不受CD9干预的影响，其抑制效应可能在于表皮迁移受损，表明CD9参与皮肤创面愈合的调控。

图5-6　CD9在小鼠创面愈合过程中的表达变化

低氧处理表皮细胞后，CD9的蛋白表达及mRNA水平均呈下降趋势。通过调控CD9在表皮细胞中的表达，划痕法建立细胞创面愈合模型，并将细胞处于低氧环境（2%氧浓度），活细胞工作站实时动态观察细胞创面愈合速率。结果显示，低氧可促进表皮细胞的创面愈合速率，而CD9在细胞中的高表达可抑制低氧对表皮细胞创面愈合的促进作用，CD9干扰后则可进一步促进低氧介导的表皮细胞创面愈合的速率。另外，还发现低氧环境可激活p38/MAPK信号通路，通过使用p38/MAPK信号通路抑制剂或MKK6（Glu）重组腺病毒转染调节低氧条件下表皮细胞中p38/MAPK信号通路的激活，证实p38/MAPK信号通路参与表皮细胞中CD9蛋白水平的调节。

为进一步观察p38/MAPK激活同CD9在表皮细胞中的调控关系，我们还对小鼠皮肤创面愈合过程中创缘移行表皮细胞中的p38/MAPK激活及CD9的表达情况进行检测。取小鼠皮肤创面不同愈合时相点（正常皮肤、伤后第5天及伤后第14天）创面组织切片，进行免疫组织荧光染色，观察在皮肤创面不同时相点时创面表皮细胞中p38/MAPK激活及CD9的表达情况。结果显示，正常皮肤表皮细胞中p-p38水平极低，未达检测水平，而CD9呈较高表达；伤后第5天时，创面移行表皮细胞中p-p38水平明显升高，而CD9则下调；当伤后第14天时，即创面再上皮化完成后，p-p38水平又下调至接近正常皮肤表皮细胞中的水平，而CD9则相应地达到正常表皮细胞中的表达量。再次说明在小鼠皮肤创面修复中，创缘移行表皮细胞内p38/MAPK激活及CD9的蛋白表达也表现出负相关趋势。这也再次佐证了表皮细胞中p38/MAPK通路对CD9表达水平的调节作用，同时由于创面形成后创缘组织处于低氧环境，这也为低氧通过p38/MAPK信号通路介导CD9表达及表皮细胞迁移调控提供了更好的证据。

本研究明确了创面修复中CD9表达水平的变化，发现创面形成早期创缘低氧微环境是介导移行表皮细胞CD9表达变化的重要因素。本研究深化了对CD9在创面愈合中作用的认识，也为揭示创面愈合规律提供了新的视角，并为创面愈合的临床治疗提供了新的可能的分子靶点。