二、活性物质的空间分布对细胞行为的影响

借助于纳米图案化表面的构建，近年来的研究成果不仅从分子层面揭示了细胞黏附的部分规律与特征，而且还相继证实基底材料上活性物质的空间分布等纳米特征能显著影响细胞的表型维持和分化等行为。

传统的研究报道表明基底材料中的配体（ligand）种类，如精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）、精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-缬氨酸（REDV）等在细胞黏附的调控中起着十分重要的作用。不仅如此，这些活性物质的空间分布在调控细胞焦点黏附的形成过程中同样扮演着重要角色。

复旦大学丁建东课题组与德国Spatz课题组利用嵌段共聚物胶束自组装辅助的方法首次平行制备了规整（六方点阵）与无规的金纳米点阵（直径约为10nm，平均间距为55～100nm），如图2-10A所示。随后在金纳米点上接枝促进细胞特异性黏附的RGD配体，从而获得活性分子RGD的纳米点阵。因为整合素（integrin）头部直径大约范围在8～12nm，而金纳米点的直径也在10nm左右，空间范围正好可以保证一个配体和整合素与其结合。在金点上接枝好RGD（每个金点对应一个RGD）和玻片背景区域接枝好抗细胞黏附的寡聚乙二醇后，Huang和Ding等人对成骨细胞MC-3T3在纳米图案表面的黏附规律作了深入研究。统计结果表明，要形成生物学意义上的焦点黏附，首先必须具备有效的整合素团簇，细胞由较好黏附到较差黏附的突变间距大约在70nm。因而，只有当有效的整合素团簇（团簇内部整合素平均间距<70nm）形成后才能形成有效的细胞特异性黏附，当平均间距>70nm时则不能形成有效黏附（图2-10）。

图2-10　活性分子RGD的空间分布对细胞黏附的影响

A.成骨细胞MC3T3-E1在不同纳米间距RGD阵列表面黏附的荧光显微照片。基底其他空白区域用自组装的PEG单分子层做钝化处理。细胞骨架F-actin标记为红色，细胞核标记为蓝色。图片左下角插入的图像为对应基底上金纳米点阵的原子力显微镜（AFM）照片。每幅图片右上角的数字代表对应基底上纳米点阵的平均间距，单位为nm，其中的字母“D”代表该图案为无规排列。B.细胞黏附机制示意图。当整合素团簇内部的平均纳米间距小于临界纳米间距（70nm）时才能形成稳定的焦点黏附复合物，进而引导细胞骨架发生组装并形成生物学意义上的焦点黏附。

引自：HUANG J H，GRATER S V，CORBELLINI F，et al.Impact of order and disorder in RGD nanopatterns on cell adhesion[J].Nano Lett，2009，9（3）：1111-1116.

图2-11　活性分子RGD的空间分布对人骨髓基质干细胞黏附和分化行为的影响

A.各类不同间距金纳米点阵的电镜照片与相应表面的细胞黏附荧光照片。第一行图片为PEG水凝胶表面不同间距金纳米点阵的场发射扫描电镜照片，平均纳米间距见图上方标识；第二行为对应不同纳米间距RGD表面上典型的细胞培养24小时后的荧光照片。细胞骨架F-actin、焦点黏附vinculin和细胞核分别被标记为红色、绿色和蓝色。B.经7天成骨诱导分化后，干细胞在不同RGD间距基底表面成骨分化的统计结果。C.经7天成脂诱导分化后，干细胞在不同RGD间距基底表面成脂分化的统计结果。

引自：Wang X，Yan C，YE K，et al.Effect of RGD nanospacing on differentiation of stem cells[J].Biomaterials，2013，34（12）：2865-2874.

上述报道揭示，形成有效的焦点黏附需要首先具备有效的整合素纳米团簇，且对团簇内部整合素的平均间距有要求，即细胞黏附存在活性分子临界纳米间距。那么，形成有效焦点黏附是否还对每个纳米团簇中配体及整合素的数量有着严格需求呢，即活性物质的数量是否也存在一个临界值？为解决这一有趣的基础科学问题，Schvartzman和Wind等进行了精心的纳米阵列设计，结合电子束刻蚀和纳米压印刻蚀技术，成功制备了具有不同排布特征的Au-Pd纳米点阵，其中包含依次由2～7个纳米点构成的6种团簇（每个纳米点的直径为8nm，团簇内点与点的间距在50～100nm范围内变化）。同样，他们也在纳米点上接枝了RGD配体并对基底空白区域进行了细胞黏附钝化处理。其研究结果表明细胞黏附不仅对团簇内部整合素的平均间距有要求（临界值在60～80nm），而且还对每个团簇中的配体及整合素的数量有需求——至少需要与4个整合素结合才能形成稳定的焦点黏附复合物，且这一临界数量与配体RGD的全局密度无关。

此外，利用精细的嵌段共聚物自组装技术并结合独到的纳米图案转移技术，复旦大学丁建东课题组在持久抗细胞黏附的PEG水凝胶基底表面成功制备了不同间距的RGD纳米点阵，间距范围为37～124nm。干细胞在其表面的黏附和分化结果首次揭示，基底材料上活性物质的空间分布（配体RGD阵列的纳米间距）是一个调控干细胞黏附与分化的独立因素。当RGD的纳米间距小于70nm时，细胞能够形成相对较好的焦点黏附，铺展面积较大；而当间距大于70nm时，很可能由于细胞不能形成稳定的焦点黏附进而导致细胞黏附效果变差，铺展面积变小（图2-11A）。干细胞的分化结果表明大的RGD纳米间距既利于成骨分化也利于成脂分化（图2-11B，图2-11C）。而微米图案领域的权威文献报道已经证实小面积仅利于成脂分化而不利于成骨分化，因而作者推断这一纳米因素对细胞分化行为的影响很可能独立于细胞黏附而直接发挥诱导作用。

为了排除上述分化差异中掺杂的细胞铺展面积因素的影响，复旦大学丁建东课题组还设计并最终在PEG水凝胶表面成功制备了微米-纳米杂合图案。在本研究中，通过微米图案来固定细胞的铺展面积，同时通过微米岛中的纳米图案来单一调控微米区域的纳米间距因素。借助这一精巧的材料手段，该课题组的研究结果率先表明，不管是在较小还是较大的铺展面积状态下，大的纳米间距与小的纳米间距相比均更利于干细胞的成骨和成脂分化，进而成功剥离铺展面积因素的影响，并证实材料表面配体RGD的纳米间距是一个独立的调控干细胞分化的因素。

活性物质的空间分布除对上述细胞黏附和骨髓基质干细胞成骨、成脂分化行为的影响外，复旦大学丁建东课题组还进一步研究揭示，此纳米因素亦能显著调控骨髓基质干细胞的成软骨分化行为甚至调控软骨细胞本身的表型维持以防止其退分化。此外，Muth和Lee-Thedieck等的研究成果还表明，配体的纳米间距对造血干细胞（hematopoietic stem cell，HSC）的分化行为也可产生显著影响。