二、材料表面分子旋光性对细胞行为的影响

“手性”（chirality）是用于描述一个物体的形态不能通过平移与旋转的操作与其镜面图像完全重叠的特征。在生物界，“同手性”（homochirality）的选择是一种普遍存在并令人着迷的现象，该特征有利于维持生物化学反应的特异性与有效性。“同手性”特征可通过核心生物分子的选择而明确体现，如地球上的生命系统总是单一地选择L型氨基酸和D型脱氧核糖分别作为其蛋白质和DNA的组成基元；此外，生物大分子的三维结构以及生物体的发育过程亦体现出明显的手性选择特征。因而，考察细胞对基底手性特征（如分子旋光性）的响应便成为一个重要的基础科学问题。

在该领域中，较为前期的研究工作主要集中在考察分子手性界面或镜像晶面对细胞黏附行为的影响。美国哈佛医学院的Yavin及其合作者在20世纪70年代便首次观察到胚胎神经细胞在聚L型赖氨酸表面的黏附明显优于聚D型赖氨酸表面。1994年，以色列魏茨曼科学院的Hanein和Geiger等观察到非洲爪蟾（Xenopus laevis）肾内皮细胞在镜像晶体表面的黏附选择特性，当将内皮细胞接种到（S，S）型和（R，R）型酒石酸钙晶体的{011}晶面上10分钟后，他们观察到（S，S）表面仅有少量细胞黏附，而（R，R）表面则黏附了较多的细胞。该研究首次揭示了细胞能够响应镜像晶体表面的细微差别。十多年后，Sun和Chi等报道了人免疫细胞在L型和D型异丁酰基半胱氨酸（NIBC）表面的黏附差异行为，实验结果表明细胞更易黏附到 LNIBC修饰的表面，其黏附数量和铺展状况均优于D型表面（图2-5A）。该课题组后续进一步的研究结果还表明：当增加材料表面的手性中心时，细胞在分子手性表面的黏附差异与偏好能得到进一步的增强。这些先驱的研究工作揭示并证实了细胞能够响应基底表面细微的分子手性特征差异。此外，Zhou和Chen等还观察到L929成纤维细胞在L型半胱氨酸和D型半胱氨酸自组装单分子层表面的黏附差异行为，并在一定程度上证实是由于L型表面能够吸附相对较多的蛋白进而促进了成纤维细胞的黏附。EI-Gindi和Kehr等近期还利用内皮细胞和C-6-glioma细胞在D型青霉胺（D-penicillamine，D-PEN）基底表面的黏附差异成功实现了两种细胞的分离。

综合上述研究表明，多种非干细胞（non-stem cells）的黏附行为受到基底表面分子手性特征的影响。随着细胞生物学、生物材料学和组织再生医学的飞速发展，干细胞由于具有自我复制更新的能力与定向诱导分化的潜能而被公认为一种十分重要的种子细胞，因而研究材料表面分子手性特征对干细胞黏附和分化等行为的影响已变得十分迫切。

近期，复旦大学丁建东课题组选择以L型和D型半胱氨酸（Cys）作为一对典型的手性分子，借助于巯基试剂的自组装技术和独到的图案转移技术成功构建了有无图案化的分子手性表面。L型和D型表面的蛋白吸附结果显示，L型表面能够吸附更多的蛋白质。模型干细胞（大鼠骨髓基质干细胞）在上述表面的响应结果表明，细胞在L型表面的黏附数量高于D型表面（但细胞的平均黏附面积小于D型表面）。干细胞经诱导分化后，L型表面成脂分化的比例高于D型表面，而D型表面的成骨分化比例却高于L型表面（图2-5B）。

为了弄清分子手性效应到底是如何达到对细胞分化行为产生影响的，本章作者课题组还在持久抗细胞黏附的PEG水凝胶表面成功制备了大小两种面积的分子手性微米图案对，分别为L-大面积（L-large）、D-大面积（D-large）和 L-小面积（L-small）、D-小面积（D-small），以此来达到对细胞黏附铺展面积的有效控制（图2-5C）。固定黏附面积后的单细胞分化结果表明在相同铺展面积下，L型和D型微米岛表面上细胞分化状况并无显著性差异，而对于不同的铺展面积而言，大的铺展面积利于成骨分化，小的铺展面积利于成脂分化，分化统计结果见图2-5C。

图2-5　材料表面的分子旋光性对免疫细胞和干细胞行为的影响

A.巨噬细胞在L-NIBC（异丁酰基半胱氨酸）和D-NIBC表面黏附24小时后的扫描电镜照片。右上角插入图片为相应组别特征区域的局部放大图，以便于清晰显示细胞的黏附铺展状态。B.骨髓基质干细胞在L-Cys（半胱氨酸）和D-Cys表面经过1周共诱导后的成骨和成脂分化结果。左图为分化后的染色显微照片，其中上行图片为成骨标志物碱性磷酸酶（标记为蓝色）和成脂标志物油滴（标记为红色）的染色结果；下行图片为对应区域细胞核（标记为蓝色）的荧光显微照片。右图为L-Cys和D-Cys表面成骨成脂分化的统计结果。C.骨髓基质干细胞在L-Cys和D-Cys微米岛上的分化结果。左图为L-Cys和D-Cys微米岛的结构示意图，其中的金层通过连接分子与PEG水凝胶基底共价连接，金微米岛表面上分别接枝有L-Cys或D-Cys从而形成大（large）、小（small）共两对分子手性微米图案。右图为L-Cys和D-Cys微米岛表面干细胞经1周共诱导后的成骨和成脂分化统计结果。

图A 引自：SUN T L，HAN D，RIEHEMANN K，et al.Stereospecific interaction between immune cells and chiral surfaces[J].J Am Chem Soc，2007，129（6）：1496-1497.

图B、C 引自：YAO X，HU Y W，CAO B，et al.Effects of surface molecular chirality on adhesion and differentiation of stem cells[J].Biomaterials，2013，34（36）：9001-9009.

上述综合研究结果首次揭示：分子手性表面上细胞分化状况的差异很可能是由于表面的分子手性特征首先导致了蛋白吸附和细胞黏附面积的差异（对应于不同的细胞应力），进而影响了干细胞的分化，影响过程如图2-6所示。随后，Deng和Gao等借助在金纳米颗粒上接枝手性聚合物[聚丙烯酰-L（D）-缬氨酸，poly acryloyl-L（D）-valine]的手段也证实了材料的分子手性特征能够影响干细胞的分化行为。

图2-6　材料表面分子旋光性对干细胞黏附和分化行为影响的过程示意图

引自：YAO X，HU Y W，CAO B，et al.Effects of surface molecular chirality on adhesion and differentiation of stem cells[J].Biomaterials，2013，34（36）：9001-9009.

综合上述代表性的研究成果可以看出，基底表面的分子手性特征不仅能够影响蛋白的吸附和细胞的黏附，甚至还能对干细胞的分化行为等产生显著影响。