三、HIV-1基因型耐药检测方法及程序

1.检测原理

常规HIV-1基因型耐药检测采用RT-PCR扩增后经过测序法获得相对应基因片段的序列，通过与野生型和耐药毒株的序列比较，分析得到耐药相关突变基因，利用基因型耐药解释系统来判断是否耐药以及耐药的程度。

2.检测方法

目前我国HIV-1基因型耐药检测采用商品化试剂盒和实验室自建（In-house）两种方法。

（1）商品化试剂盒：

目前经国家市场监督管理总局批准通过的检测试剂盒有中山大学达安基因股份有限公司的人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）耐药基因型检测试剂盒（PCR-测序法）和美国ViroSeqTM［HIV-1基因型耐药分析检测试剂盒（核酸扩增荧光定量及测序法）］。

（2）实验室自建（In-house）方法：

根据所测目的基因的序列设计引物，包括反转录、PCR扩增和测序引物。使用套式PCR方法，第一轮采用RT-PCR扩增，进行两轮扩增，产物进行测序后得到相应基因片段序列。耐药基因型检测需扩增HIV-1的 pol基因区，目的基因片段应至少覆盖蛋白酶区4-99位氨基酸和反转录酶区38-248位氨基酸的基因区域。

3.耐药分析

（1）商业化试剂盒使用与试剂盒配套的HIV-1基因型耐药检测的解释系统。

（2）In-house方法将所测样本序列与数据库中的参考序列或共享序列进行比较，判断是否出现耐药相关的基因突变。通常使用艾滋病毒数据库（human immunodeficiency virus data base，HIVDB系统），判断耐药相关突变和组合的耐药程度。

（3）根据HIV-1基因型耐药解释系统的规则来评判对特定药物的耐药程度。

4.结果报告和解释

（1）耐药相关的基因突变：应分基因区报告耐药相关的基因突变，如将蛋白酶（protease，PR）和反转录酶（reverse transcriptase，RT）两个基因区的基因突变分开报告。基因突变以“字母—数字—字母”的书写方式来表示，第一个字母代表野生型病毒株特定密码子处的氨基酸，第二个字母代表在特定密码子处替换了的氨基酸。

（2）耐药程度分析

1）ViroSeqTM试剂盒将耐药程度分为敏感（S）、可能耐药（I）和显示耐药（R）3个水平，其中后2个水平为耐药。

2）HIVDB系统将耐药程度分为敏感（S）、潜在耐药（P）、低度耐药（L）、中度耐药（I）和高度耐药（H）5个水平，其中后3个水平为耐药。

（3）当耐药毒株在个体内病毒群体中的比例低于10%～20%时，通常检测不到其存在，因此未检出耐药时，只可报告本次实验结果为“未发现耐药”，不可报告为“敏感”。

5.质量控制与质量保证

为保证检测结果的可靠性和有效性，必须进行质量控制，包括从样本接收到发出检测报告的全过程，主要分为室内质量控制（室内质控）和外部质量控制（外部质控）。

（1）室内质控

1）检测过程质量控制：

①使用商品化试剂盒须按照试剂盒要求严格执行。②In-house方法除待测样本外，还应设立阳性、阴性和空白对照。③从样本核酸提取开始加入阴性和阳性对照，每次检测应至少加入一个阴性对照和一个阳性对照，建议阴性对照与待测样本的比例不小于1：22，其中阴性对照应随机放置在待检样本中。从RT反应开始加入空白对照。④只有在阳性对照扩增出预期片段，阴性对照和空白对照没有任何扩增片段，并且分子进化树分析没有交叉污染的情况下，实验才成立。

2）试剂质量控制：

试剂批号变更时，可增加阳性对照数量，将本次试验阳性对照的结果与已知结果进行比较，以检验试剂的可靠性和稳定性。

3）定期进行实验室内部质量评价：

随机选择经耐药基因型检测过的样本，进行盲样检测，比较序列以及耐药位点图谱。

（2）外部质控：

开展HIV-1耐药检测的实验室每年至少接受二次国家级实验室能力验证（PT），通过考核后方可进行检测。有条件的实验室可参加国际认可机构的质控。