第三节 HPV疫苗的基础研究
【培训目标】
1.了解
HPV疫苗的生物学基础及预防HPV相关疾病的原理、目前国内外HPV疫苗的研发现状。
2.熟悉
HPV疫苗的安全性、有效性和免疫持久性（主要为上市前临床研究数据）。
3.扩展
HPV疫苗研发历程和质量控制。
【主要内容】
1.人乳头瘤病毒（HPV）病毒学概述
2.HPV的致病机制
3.HPV预防性疫苗的保护机制
4.HPV预防性疫苗
一、人乳头瘤病毒（HPV）病毒学概述
1.HPV的病毒分类
人乳头瘤病毒为乳头瘤病毒科乳头瘤病毒属，HPV主要集中在乳头瘤病毒的 alpha、beta、gamma、mu和nu 5个属中，型别超过200种。
HPV是一类无包膜的双链DNA病毒，组织特异地感染人上皮细胞，引起各种良性和恶性上皮异常增生。
根据L1的氨基酸序列同源性进行分类（图1-3-1）
● 40%～60%，Genus属；
● 60%～70%，Species种；
● 70%～90%，Type型；
● 90%～98%，Subtype亚型；
● ＞98%，Variant型内变异。
图1-3-1 HPV系统进化树
注：红色粗体为 13 个高危型别（HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68），蓝色粗体HPV6、11型别为现有子宫颈癌疫苗中包含的低危型别
2.HPV型别与相关疾病
根据HPV感染部位不同可分为嗜皮肤型和嗜黏膜型：
●嗜皮肤型：主要引起表皮的良性病变，如扁平疣、寻常疣、跖疣及疣状表皮发育不良。
●嗜黏膜型：主要引起内外生殖器和肛门部位的良性和恶性病变以及口腔和咽部的病变，如子宫颈癌、肛门癌、口咽癌和尖锐湿疣等。
根据HPV感染诱导癌症的潜力将HPV（主要为嗜黏膜型）分为高危型和低危型：
●高危型：主要引起宫颈、阴道、外阴、阴茎、肛门、口腔、口咽和喉部的上皮内瘤变或癌变。
●低危型：主要引起皮肤、肛门外生殖器良性病变，常见的如皮肤疣和生殖器疣。
国际癌症研究机构（IARC）根据已有证据，将HPV分为：
● 致癌型（Group 1）：HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59。
●很可能致癌型（Group 2A）：HPV 68。
上述2组共13个型别为高危型HPV，其余HPV型别为低危型HPV，包括可能致癌型（Group 2B）或非致癌型（Group C）。
全球每年新发的与HPV感染相关的癌症病例数高达120万人，其中63万（52.5%）是由于HPV感染直接导致的，最常见的为子宫颈癌，每年新发病例数为53万（图1-3-2）［1］。
图1-3-2 HPV相关癌症分布情况［1］
注：图中百分比为归因于HPV感染所占的比例
3.HPV基因组结构
HPV病毒基因组DNA长度约为7.2～8kb，包括8个开放阅读框，根据基因表达顺序分为早期区（early region，ER）和晚期区（late region，LR）。
其中早期区主要编码病毒早期蛋白 E1～E7，E1和E2蛋白主要参与病毒的DNA复制，E4蛋白帮助病毒逃逸，E5、E6和E7蛋白是病毒的致癌蛋白。
晚期区编码病毒的衣壳蛋白：即主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白 L2，两者共同形成病毒的衣壳。L1蛋白的晶体结构已解析，而L2的结构仍未报道（图1-3-3）。
图1-3-3 HPV基因组结构
注：早期区约包含4.5kb碱基，主要编码病毒早期蛋白E1～E7，晚期区包含～3kb碱基，编码两个病毒衣壳蛋白。目前关于L2的结构仍未报道。在体外，L1蛋白形成五聚体，并自组装成HPV类病毒样颗粒（viruslike particles，VLPs）
4.HPV主要衣壳蛋白L1的结构研究
HPV L1蛋白质晶体结构显示单体主要由5个α螺旋区（α helix）和10个β-折叠（β-sheet）组成的折叠桶状（β-barrel）核心区以及位于β-折叠之间的BC、DE、EF、FG和HI五个环区（loop）构成（图1-3-4a），loop区是HPV L1主要中和表位所在区域。
HPV L1蛋白在体外可高效表达，形成五聚体（图1-3-4b），并在体外自组装成病毒样颗粒（图1-3-4d和e）。二硫键的形成对VLP的形成至关重要（图1-3-4c），主要由相邻L1蛋白间的Cys175和Cys428介导形成，二硫键的正确形成与否与病毒的成熟度相关［2-3］。
图1-3-4 HPV L1单体和病毒样颗粒三维结构
注：HPV L1单体主要由α1、α2、α3、α4和h5五个α螺旋区、10个β-折叠以及五个环区（loop）构成（图a）。 胞内表达的L1蛋白多以五聚体（图b）形式存在，并在体外自组装成类病毒样颗粒（图d，e）。二硫键的形成对VLP的形成至关重要（图c），主要由相邻L1蛋白间的 Cys175和Cys428介导形成
5.HPV主要衣壳蛋白L1的中和表位研究
●目前研究表明HPV主要衣壳蛋白L1的中和表位主要集中在BC、DE、EF、FG和HI的五个高度变异的环区（loop）及“悬挂桥”区域，不同型别的主要中和表位分布存在一定的差异（图1-3-5）［4-5］。
图1-3-5 HPV L1中和表位研究
注：HPV16的中和表位主要集中在BC、DE、EF、FG、HI和悬挂桥上，不同抗体识别的表位不一致。其中1A抗体识别表位位于DE、FG和HI环区，V5抗体识别表位位于DE、EF、FG和HI环区，14J抗体识别表位包含五个环区（BD、DE、EF、EG和HI环），263A2抗体识别表位在DE、EF、FG和HI环区，U4抗体识别表位位于悬挂桥处。抗体A12A3识别HPV58的中和表位位于DE环区，抗体28F10识别HPV59的中和表位位于FG和HI环区
二、HPV的致病机制
1.HPV感染和致癌过程
持续感染HPV是诱发子宫颈癌的最主要原因，一般感染HPV后90%会在2年内自行清除，2年内5%～7%会发展成CIN2/3（图1-3-6）。
高危型和低危型差异：现有证据表明，仅高危型HPV E6和E7蛋白的异常表达可促使原代角质细胞永生化并诱导宿主基因组不稳定。
图1-3-6 HPV感染和致癌过程以及病变发生率［6］
注：从良性宫颈病变发展至浸润性宫颈癌的过程。高危型HPV感染，特别是HPV16，可能直接导致良性湿疣病变、低度不典型增生，有时甚至是早期高度病变。原位癌由HPV基因的联合作用导致，特别编码E6蛋白和E7蛋白的基因。其过程为：病毒DNA整合到宿主基因组中，E6蛋白及E7蛋白高表达，导致细胞基因的一系列遗传和表观遗传变化，最终使宿主细胞完成恶性转化。HSIL：高度鳞状上皮内病变；LSIL：低度鳞状上皮内病变
2.全球和我国不同宫颈病变中HPV的型别分布
宫颈病变程度越严重，高危型HPV的检出率越高，尤其是HPV16和18型，ICO HPV信息中心报告其在全球和我国的子宫颈癌患者中感染率均占70%左右（图1-3-7）［7］，但来自中国医学科学院肿瘤医院的中国多中心研究显示在宫颈鳞癌中该比例为84.5%［8］。
图1-3-7 不同宫颈病变中最常见的十个HPV型别
3.不同型别HPV感染机体后致癌性的比较
HPV16感染后导致高度宫颈病变的危险性最高，其次为HPV18（图1-3-8）。
图1-3-8 波兰女性HPV感染发生情况的10年随访分析
注：波兰20 514例妇女的10年随访结果，HC2+指的是HC2检测中除16、18型之外其余高危型别阳性
三、HPV预防性疫苗的保护机制
1.HPV VLP疫苗的作用原理（图1-3-9）
HPV疫苗免疫机体后会诱发机体免疫系统产生血清中和抗体。
血清抗体可以透过血管壁，在局部的上皮组织中达到一个较高的浓度。
当HPV病毒通过黏膜上皮的细微伤口接触到基底细胞时，位于上皮组织中的血清抗体即能与HPV病毒相互作用，阻碍病毒感染细胞，进而发挥中和作用，预防病毒感染。
图1-3-9 HPV VLP疫苗保护机制
2.HPV中和抗体阻碍病毒感染的机制
HPV 感染过程［6］：
●L1与受体作用，吸附细胞。
●L1发生构象变化，L2 N端暴露。
●L2被Furin识别并经酶切，暴露第二受体结合位点。
●L2与受体的识别，介导细胞内吞HPV。
HPV中和抗体作用模式［6］：
●阻断病毒与入胞受体吸附。
●阻止病毒衣壳构象变化，并阻碍病毒入胞。
●阻止病毒次要衣壳蛋白L2的暴露，并阻碍入胞。
注：HPV可与上皮细胞表面或基底膜上的硫酸肝素蛋白多糖（HSPG）结合，也能与细胞外基质（ECM）上的层粘连蛋白（Laminin-332）结合。表皮生长因子受体（EGFR）或角质形成细胞生长因子受体（KGFR）也可能在此时通过HSPG、生长因子、HPV三者形成的复合物被激活，并启动细胞内信号级联反应，例如激活磷酸肌醇3-激酶（PI3K）途径。此后，病毒粒子经历一系列的构象变化，在亲环素（CyPB）促进作用下，L2蛋白会暴露出更多的N末端氨基酸。随后，HPV结合整合素启动第二次细胞内信号级联反应。在经历构象变化和信号转导后，病毒经网格蛋白、小窝蛋白等入胞相关蛋白介导进入内吞囊泡，形成内吞入胞途径
四、HPV预防性疫苗
1.HPV疫苗研发里程碑
2.HPV疫苗研发史
（1）早期实验室及流行病学证据
●在动物和人体内，病毒可导致皮肤和黏膜乳头瘤（疣）。
●棉尾兔乳头瘤病毒诱导的表皮疣可发展为鳞状细胞癌，病毒致癌性可被化学致癌剂增强；然而未发现人体普通的疣可进展为肿瘤。
●19世纪中期，发现子宫颈癌与性传播感染有关：在性工作者中高发，在女性出家者或处女中极少见。
●1970年，发现子宫低度内皮病变的细胞中有带空泡的核，与皮肤疣中的组织学特征相近，发现空泡核中含有典型的HPV病毒结构特征，暗示子宫颈癌前病变是病毒诱导的。
●1970年，基于核酸杂交，发现很多从疣体中分离的HPV型别。
●1983年，Harald zur Hausen（2008年诺贝尔生理学或医学奖获得者）从子宫颈癌活检标本中克隆出HPV 16基因，该序列探针与50%以上的子宫颈癌标本杂交阳性。
●随后发现HPV 16/18的E6和E7基因在子宫颈癌组织和子宫颈癌细胞株中表达。
●将HPV分为高危和低危：HPV6/11导致尖锐湿疣和其他良性病变，但是不导致肿瘤；高危型也导致良性病变，但在鳞柱交接的转化带非常倾向于导致恶性病变。
●1990年前后，发现高危HPV的E6和E7基因可永生化人类表皮细胞株，包括宫颈和包皮的角质细胞。可抑制p53和pRb等抑癌基因。
●由于分子诊断水平不足，无法明确HPV感染状态，导致最初的病例对照研究不支持上述实验室结果。
●PCR试剂进步，随后证明高危HPV感染是子宫颈癌的高危因素，相对危险度（RR）高于100。
●21世纪初，确认高危HPV感染是子宫颈癌的核心因素（必要非充分）。
（2）1990年，启动HPV疫苗研究
不考虑减毒或灭活疫苗的两个原因：
a：HPV无法在细胞模型中培养；
b：HPV至少含有E5/E6/E7三个致癌基因，存在安全性隐患。
理解HPV结构为无包膜二十面体衣壳含有360个L1和12～72个L2。
野生型病毒进行腹腔或肌内注射可诱导中和抗体，预防后续的病毒感染；而变性或者非正确构象的L1则不行，提示疫苗中需要包含完整的正确构象L1单位。
已知：部分无包膜二十面体衣壳病毒可自装配成VLP，如多瘤病毒、乙肝病毒。
1991年，周健博士和Frazer教授在CV-1细胞中用痘病毒载体共表达L1和L2形成35～40nm（HPV病毒直径为50～55nm）VLP，被认为是“不完全正确组装的HPV壳粒阵列”。当时没有合适的中和抗体实验平台，无法评估其作为HPV疫苗的潜力。
（3）启动HPV疫苗研究
随后以SV40病毒载体在COS细胞表达HPV1的L1，但未形成VLP。
John Schiller等用杆状病毒系统表达出BPV L1 VLP，直径50nm，且能诱导出极高滴度的中和抗体（100 000）。这证明BPV L1自身可组装成VLP，且诱导极高滴度抗体。然而表达出的HPV L1无法组装成VLP?
可能原因1：L1表达量不足——表达出足量HPV16 L1仍不形成VLP。
可能原因2：不同型HPV L1自装配能力不同——前期已表达出恒河猴乳头瘤病毒（RhPV1）L1蛋白组装成VLP。
思考：可能是使用的HPV L1基因缺陷。
A：改用低度病变组织中分离的HPV16 L1，组装出VLP，发现精氨酸到组氨酸的突变，导致组装缺陷。
B：之后不同实验室用不同的表达系统陆续表达出HPV L1 VLP。
（4）HPV疫苗研究的快速发展
随后动物实验证明COPV、CRPV、BPV4的L1 VLP可在狗、兔子和牛中保护病毒攻击。
建立中和抗体检测平台：
A：L1和L2包裹BPV基因假病毒细胞中和模型。
B：L1和L2包裹报告基因假病毒细胞中和模型。
C：假病毒小鼠阴道感染动物保护评价模型。
证明HPV为型特异性，而同一型别内不存在不同的血清型。
多种细胞表达系统制备HPV L1蛋白。
HPV L1蛋白体外组装研究工艺成熟。
HPV L1蛋白结构研究取得显著成效。
启动多价HPV疫苗临床研究。
3.HPV主要衣壳蛋白L1的病毒样颗粒疫苗
L1蛋白可自组装成VLP
HPV衣壳蛋白L1可在体外自组装成病毒样颗粒（VLP），无病毒核酸，不具有感染能力，与真病毒结构高度相似，具有较高的免疫原性，能诱发机体产生具有较高的保护性中和抗体（图1-3-10）。
图1-3-10 HPV VLP组装过程
注：由5个HPV L1单体组装成一个HPV五聚体，72个五聚体组装成T=7d的正二十面体病毒样颗粒
HPV L1疫苗制备过程（图1-3-11）
图1-3-11 HPV VLP疫苗制备过程
注：首先将L1基因整合至相应的表达载体，之后将表达载体导入相应的表达系统（包括酵母、杆状病毒-昆虫细胞以及大肠埃希菌表达系统）中，并经过纯化、组装过程得到HPV VLP，与佐剂混合制备成HPV VLP疫苗，之后进行临床前及临床试验，验证疫苗的安全性和有效性
4.HPV疫苗的质量控制
理化性质检测：蛋白的大小，粒径，各组分含量等。
结构确证：N端和C段测序、氨基酸组成、质谱分子量、肽图指纹、三维结构解析等。
杂质去除检测：无菌检测，热原检测，异常毒性检测等。
效力检测：免疫小鼠和食蟹猴并进行细胞中和实验检测。
抗原鉴定：HPV型别特异L1蛋白VLP。
抗原含量：＞95%。
半数有效剂量ED50。
DNA 残余量：＜10ng/剂。
宿主蛋白残余量：＜0.1%。
内毒素：＜5EU/剂。
佐剂。
5.HPV疫苗安全性和有效性评价
（1）HPV疫苗安全性评价
单次肌内注射给予ICR小鼠的毒性试验：解剖分析毒性反应。
重复肌内注射给予SD大鼠12周和恢复期4周的毒性试验：进一步评价毒性反应以及可能出现的延迟性毒性反应。
给予豚鼠的全身过敏反应试验：分析速发型全身过敏反应。
重复肌内注射给予SD大鼠生殖发育毒性试验：分析疫苗对生育能力、妊娠、哺乳、胚胎以及胚胎发育的影响。
（2）HPV疫苗有效性评价
主要采用假病毒-细胞体外中和检测模型，流程如图1-3-12：
图1-3-12 HPV假病毒-细胞体外中和检测示意图
注：将携带GFP报告基因的HPV假病毒与待检测系列梯度稀释血清孵育，然后加入贴壁的293FT细胞中，培养 72小时，通过与阳性和阴性对照组比较，分析实验组中GFP蛋白的表达强度，计算出血清阻断50%病毒感染的临界点，进而判断血清的中和滴度值
6.HPV疫苗临床试验
（1）临床试验设计
Ⅰ期临床试验
主要研究目的：研究不同剂量、不同配比受试疫苗的安全性和耐受性。
Ⅱ期临床试验
主要研究目的：探索不同剂量、不同配比受试疫苗在目标人群中的免疫原性（和保护率）及安全性，以期选择最优剂量和配比的受试疫苗进入下一阶段评估。
Ⅲ期临床试验
主要研究目的：评价疫苗的保护效果和安全性，研究终点主要包括病毒学终点（疫苗型别相关的一过性感染、6个月持续性感染和12个月持续性感染）和组织学终点（疫苗型别相关高度癌前病变）。
桥接试验
主要研究目的：评价疫苗（不同免疫程序）在青少年中的免疫原性是否非劣效于成年女性。
（2）临床试验安全性评价：国内外临床试验数据表明已上市的进口疫苗和目前已完成三期临床试验的国产疫苗均有良好的安全性（表1-3-1）［9-11］。
表1-3-1 HPV疫苗国内Ⅲ期临床试验安全性数据的比较
注：试验对象年龄：国产二价疫苗为18～45岁；进口四价疫苗为20～45岁；进口二价疫苗为18～25岁
（3）HPV疫苗上市后安全性分析［12-15］
至少已有2.7亿支HPV疫苗被使用，大量监测数据证明了疫苗的长期安全性。
●局部和全身不良反应常见，通常较轻微。局部疼痛、红肿最为常见。
●疫苗可能有关的严重不良事件（SAE）十分罕见，与其他疫苗类似。
● WHO全球疫苗安全顾问委员会（GACVS）于 2007、2008、2009、2013、2014、2015、2017年系统审查了HPV疫苗的安全性数据，认为已上市的2个疫苗均是安全的。
●GACVS特别审查了吉兰-巴雷综合征、复合性区域疼痛综合征（CRPS）、体位性心动过速综合征（POTS）、妊娠相关症状等，未发现其与疫苗接种的因果关系。
●国际妇产科联盟（FIGO）审查了现有数据后，支持HPV疫苗在适用人群中的持续使用。
●接种HPV疫苗不会增加不良妊娠结局的风险。
（4）免疫原性与免疫持久性考察［9，16，17］
15～45岁男女性
●免疫原性：已上市HPV疫苗均具有良好的免疫原性，血清阳转率几乎均为100%，抗体滴度在全程免后一个月达到峰值，为自然免疫产生抗体滴度的100倍。
●免疫持久性：疫苗免后2年抗体滴度达到平台期，约为自然免疫获得的抗体滴度的10倍，目前进口二价和四价疫苗分别报道了免后10年和9.4年的数据，国产二价疫苗报道了免后3.5年的数据。
●保护性抗体水平：由于未出现突破病例，目前尚无法确定保护性抗体水平的界值。
9～14岁男女性
●间隔6或12个月接种2针疫苗均可产生不低于15～26岁女性接种3针疫苗的抗体滴度。
●间隔6个月接种2针疫苗均可产生非劣效于同年龄段女性接种3针疫苗的抗体滴度。
●若进行2针接种程序，2针间间隔越长免疫原性越好：0个月/12个月程序优于＞0个月/6个月程序。
（5）国外临床试验中的有效性：国外临床数据表明已上市的疫苗对15～45岁女性均有保护性，但由于大年龄组女性人数较少，试验组与对照组的差异无统计学意义（表1-3-2）［10，11，18］。
表1-3-2 进口HPV疫苗对国外不同年龄段女性的保护性
在我国开展的临床试验中的有效性：国内临床试验数据表明已上市的进口疫苗和目前已完成三期临床试验的国产二价疫苗对女性均有较好的保护性（表1-3-3）［9，19，20］。
表1-3-3 HPV疫苗国内Ⅲ期临床试验有效性数据的比较
注：数据收集时长：HPV16/18（大肠埃希菌）随访3.5年；HPV16/18（昆虫细胞表达）随访6年；HPV6/11/16/18（酵母表达）随访6.5年；试验对象年龄：HPV16/18（大肠埃希菌）为18～45岁；HPV16/18（昆虫细胞表达）为18～25岁；HPV6/11/16/18（酵母表达）为20～45岁
*显示数据为HPV 6/11/16/18四个型别的持续感染病例数
【要点总结】
1.人乳头瘤病毒是一类无包膜的双链DNA病毒，感染宿主上皮细胞后引起各种良性和恶性上皮异常增生；其早期蛋白为致癌蛋白，主要衣壳蛋白L1可在体外表达和自助装形成病毒样颗粒，富含中和表位，是理想的疫苗分子。
2.HPV持续感染是诱发子宫颈癌的最主要原因，高危型HPV E6和E7蛋白的异常表达是促使原代角质细胞永生化并诱导宿主基因组不稳定的主要因素；一般感染HPV后90%会在2年内自行清除，5%～7%会发展成CIN2/3。
3.HPV疫苗免疫机体后会诱发机体免疫系统产生高滴度的血清中和抗体，该抗体通过阻碍病毒与宿主表面受体相互作用，进而阻碍病毒入胞，达到预防病毒感染的作用。
4.基于HPV病毒自身特点，利用真核和原核表达系统制备的HPV L1 VLP是一种理想的疫苗形式，该疫苗已在国内外上市或已完成三期临床试验，临床试验显示该疫苗具有良好的安全性和有效性以及免疫持久性，可有效地预防子宫颈癌、肛周及外生殖器肿瘤和尖锐湿疣等疾病的发生。
（吴婷 张军）
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